王 飛，李雪夢，楊 瑾，文 藝，趙晨晨，趙 瑩，劉玉霞，高素霞，戚文平，秦艷紅，魯傳濤

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所，河南 鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，河南 鄭州 450002）

丹參（Salvia miltiorrhiza）以根入藥，可用于治療心絞痛、冠心病等心腦血管疾病，是我國傳統(tǒng)中醫(yī)中應(yīng)用最早、最廣泛的藥材之一[1]。在丹參栽培過程中，根腐病、枯萎病等發(fā)生危害嚴重，是造成產(chǎn)量損失和連作障礙的重要因素[2-4]。單一化學(xué)防治持效性差，并對環(huán)境和藥材質(zhì)量造成嚴重影響[5]，因此，生產(chǎn)中亟需開發(fā)新型生物防治制劑來控制根腐病的發(fā)生，以達到生產(chǎn)安全丹參藥材的目的。植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）具有促進植物生長和抵抗生物及非生物脅迫的功能，已被廣泛用于提高作物產(chǎn)量和降低病害的發(fā)生[6]。合理利用丹參PGPR 菌的生防、促生作用，通過PGPR 菌的定殖來促進丹參健康生長，減少化肥農(nóng)藥的使用，將為丹參綠色安全栽培技術(shù)提供新的思路和策略。

目前，丹參PGPR 菌的篩選和應(yīng)用取得了一定進展。DUAN 等[7]從丹參根系中分離出的內(nèi)生細菌阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）B5 能分泌2 種代謝物，其對丹參的3種致病鐮刀菌具有抑制作用。段佳麗等[8]從萬余株放線菌中篩選出1 株多功能放線菌密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum）Act12，可顯著提高丹參產(chǎn)量及藥材中丹參酮ⅡA、丹酚酸B 和丹參素的含量。周瑩等[9]從丹參根際分離到的枯草芽孢桿菌（B. subtilis）2-1 和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）9-2，對 丹 參 根 腐 病 菌（Fusarium solani）有較好的抑制作用。以上關(guān)于丹參PGPR 菌的研究中，未見同時具有根腐病防治效果和促生作用的菌株，關(guān)于丹參根腐病的防治，也僅限于對病原菌的室內(nèi)抑菌測定研究。鑒于此，擬從野生健康丹參根際土進行根際細菌的分離，結(jié)合平板對峙和吲哚乙酸（IAA）分泌能力測定篩選高效PGPR 菌株，并通過盆栽試驗對各菌株的作用進行評價，以期篩選出兼具丹參根腐病防治效果和促生作用的PGPR 菌株，為丹參生物菌劑的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試病原菌為丹參根腐病菌層出鐮刀菌（F.proliferatum），由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所中藥材病蟲害研究室分離保存。

供試土壤為河南省嵩縣車村鎮(zhèn)野生健康丹參根際土壤。

1.2 根際細菌分離與純化

采用稀釋涂布平板法[10]，從丹參根際土壤中分離細菌。取土樣1 g，置于裝有9 mL無菌水的50 mL離心管中，28 ℃、200 r/min 振蕩30 min。將土壤依次稀釋成10-3、10-4、10-5懸浮液，吸取稀釋液100 μL均勻涂布于準備好的KB 平板上，每個梯度重復(fù)3次。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取不同類型的菌落于KB 平板上純化2～3 次，接種于KB培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，菌液與50%甘油按照體積比1∶1 混合保存于凍存管中，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 根際促生細菌篩選

1.3.1 初篩 采用平板對峙法[11]篩選對丹參根腐病原菌具有拮抗作用的細菌。以生長5 d 的病原菌F.proliferatum為指示菌，于菌落邊緣打取5 mm 直徑的菌絲塊，接種至PDA 平板中心位置，在菌落四周點接純化好的細菌，共培養(yǎng)6 d 后觀察細菌與病原菌的對峙結(jié)果，初篩出對病原菌具有抑制效果的細菌。

1.3.2 復(fù)篩 將病原菌F. proliferatum接種到PDA平板中央，牙簽刮取生防細菌，在距離病菌2.5 cm處兩側(cè)各劃1 條3 cm 長的直線，對照只接種病原菌，每處理3個重復(fù)，將接種病原菌和生防菌的平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，測量病原菌的直徑，計算抑菌率。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-5 mm）×100%。

1.4 胞外水解酶活性測定

參照REN 等[12]的方法，分別挑取根際促生細菌單個菌落，接種于脫脂奶粉培養(yǎng)基、β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基和羧甲基纖維素酶檢測培養(yǎng)基上，分別對其蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶和纖維素酶等胞外水解酶活性進行檢測。

1.5 IAA檢測

參考PATTEN 等[13]的方法，將初篩得到的根際促生細菌的種子液（OD600=0.5）分別接入無L-色氨酸和添加L-色氨酸（2 mg/mL）的KB 培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d 后，測定發(fā)酵液中IAA的含量。

1.6 根際促生細菌鑒定

1.6.1 形態(tài)鑒定 將根際促生細菌劃線于KB 平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察菌株的菌落培養(yǎng)特征。

1.6.2 分子鑒定 采用CTAB 法[14]提取細菌的基因組DNA，利 用16S rRNA 基因通用引物27F（5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTAG-3＇）和 1492R（5＇ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）對基因組DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物測序后在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對。下載近似種同源序列后，基于鄰接法應(yīng)用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位，設(shè)Bootstrap值為1 000[15]。

1.7 根際促生細菌生理生化特性測定

參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]對根際促生細菌菌株進行生理生化特性測定，包括產(chǎn)過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、甲基紅試驗、V-P 測定試驗、丙二酸鈉利用試驗、碳源利用試驗、解無機磷試驗、解有機磷試驗、固氮試驗、產(chǎn)嗜鐵素試驗和產(chǎn)氫氰酸試驗，每處理3次重復(fù)。

1.8 根際促生細菌盆栽試驗

1.8.1 生防作用評價 將丹參種子消毒后在濾紙上萌發(fā)，移入含滅菌土的營養(yǎng)缽培養(yǎng)20 d，澆灌菌懸液（107～108cfu/mL），灌根量為5 mL，共灌根2 次，間隔時間為7 d，以分別接種同樣體積無菌水和50%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍液作為對照，即無菌水對照組（CK1）和50%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍液對照組（CK2）。第2 次灌根3 d 后接種丹參根腐病菌F. proliferatum孢子懸浮液（1×106個/mL）5 mL。每處理3個重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，60 d后統(tǒng)計病情指數(shù)并計算防治效果[17]。

防治效果=（對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對照組病情指數(shù)×100%。

1.8.2 促生作用評價 將丹參種子消毒后在濾紙上萌發(fā)，移入含滅菌土的營養(yǎng)缽培養(yǎng)20 d，澆灌發(fā)酵液（107～108cfu/mL），灌根量為5 mL，共灌根2 次，間隔時間為7 d，以分別接種同樣體積無菌水和KB培養(yǎng)液作為對照，即無菌水對照組CK1）和KB 培養(yǎng)液對照組（CK2）。每處理4 個重復(fù)。培養(yǎng)60 d 后調(diào)查丹參生長指標，測量株高、根長、葉寬、葉長、分根數(shù)，并分別稱量莖葉鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參PGPR細菌的初篩和復(fù)篩

從6 份根際土樣中共分離純化出了657 株細菌，以丹參根腐病菌F. proliferatum為指示菌，初篩出66 株具有拮抗作用的細菌。復(fù)篩結(jié)果（圖1）表明，菌 株K03-4、Pp03-41 和Pp146 對 病 原 菌F.proliferatum有顯著的拮抗作用，抑菌率分別為66.15%、61.03%、48.21%。

圖1 3株P(guān)GPR細菌與丹參根腐病菌的平板對峙效果Fig.1 Plate confrontation effect of three PGPR strains against pathogenic F.proliferatum

2.2 丹參PGPR細菌的胞外水解酶活性測定

PGPR 菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 在脫脂奶粉培養(yǎng)基上均能夠產(chǎn)生透明圈（圖2A），表明3 株P(guān)GPR 菌株均能夠分泌蛋白酶。菌株K03-4 和Pp03-41 能在β-1，3-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基上（圖2B）和羧甲基纖維素酶檢測培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈（圖2C），透明圈大小隨著時間的推移而增大，表明菌株K03-4 和Pp03-41 能夠分泌β-1，3-葡聚糖酶和纖維素酶；而菌株P(guān)p146不能在2種培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，說明其不具備分泌這2種酶的能力。

圖2 3株丹參PGPR細菌的胞外水解酶活性檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of extracellular hydrolase activity of three PGPR strains from S.miltiorrhiza

2.3 丹參PGPR細菌的IAA測定

從圖3 可看出，菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146在無色氨酸添加的KB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d 后，IAA 的分泌量分別為5.05、15.57、18.51 μg/mL，菌株P(guān)p03-41 與Pp146 分泌的IAA 量顯著高于菌株K03-4；在有色氨酸添加的KB 培養(yǎng)液中，菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 的IAA 分 泌 量 分 別 為51.37、61.35、78.33 μg/mL，菌株P(guān)p146 分泌的IAA 量顯著高于K03-4 菌株。3 株P(guān)GPR 菌株在無色氨酸和有色氨酸的KB培養(yǎng)液中均能夠分泌IAA，且在有色氨酸添加的培養(yǎng)液中IAA 的分泌量均高于無色氨酸添加的IAA分泌量，其中菌株P(guān)p146分泌的IAA量最高。

圖3 3株丹參PGPR細菌分泌IAA的能力Fig.3 Ability of three PGPR strains from S.miltiorrhiza to produce IAA

2.4 丹參PGPR細菌的鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)鑒定 KB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3 d，K03-4菌落為乳白色，表面扁平濕潤，圓形，菌落稍小；菌株P(guān)p03-41 菌落為乳白色，表面有褶皺濕潤，圓形，菌落大；菌株P(guān)p146 菌落為乳白色，表面稍隆起干燥，圓形，菌落?。▓D4）。菌體桿狀有芽孢。

圖4 3株丹參PGPR細菌的菌落形態(tài)特征Fig.4 Colony morphology characteristics of three PGPR strains from S.miltiorrhiza

2.4.2 分子鑒定 將菌株的16S rRNA 基因測序結(jié)果在NCBI 上進行BLAST 比對，K03-4 與多黏類芽孢桿菌［Paenibacillus polymyxa（CP017968.3）］同源相似率為99.74%；菌株P(guān)p03-41 與多黏類芽孢桿菌［P. polymyxa（CP010268.1）］同源相似率為99.80%；菌株P(guān)p146 與多黏類芽孢桿菌［P. polymyxa（CP042272.1）］同源相似率為98.81%。隨后利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果（圖5）顯示，菌株K03-4 與P. polymyxa（CP017968.3）的遺傳距離最近，置信度為89%；菌株P(guān)p03-41 與P.polymyxa（CP010268.1）的遺傳距離最近，置信度為86%；菌株P(guān)p146 與P. polymyxa（CP042272.1）的遺傳距離最近，置信度為91%。

圖5 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 均 為 多 黏 類 芽 孢 桿 菌（P.polymyxa）。

2.5 丹參PGPR細菌的生理生化特性測定結(jié)果

對3 株P(guān)GPR 菌株的生理生化指標測定結(jié)果顯示，僅菌株K03-4 能夠利用丙二酸鈉；菌株K03-4和Pp03-41在有機磷和無機磷培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生解磷圈，而菌株P(guān)p146 僅在無機磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生解磷圈；3株P(guān)GPR菌株均產(chǎn)過氧化氫酶，不產(chǎn)氫氰酸，明膠液化、淀粉水解、V-P 測定、葡萄糖利用、乳糖利用、甘露醇利用、解無機磷、固氮、產(chǎn)嗜鐵素等表現(xiàn)一致，均為陽性；甲基紅試驗結(jié)果均為陰性（表1）。

表1 3株丹參PGPR細菌的生理生化特性情況Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of three PGPR strains from S.miltiorrhiza

2.6 丹參PGPR細菌的盆栽試驗效果評價

2.6.1 生防作用評價 接種丹參根腐病菌F.proliferatum60 d 后，無菌水對照組（CK1）的病情指數(shù)為67.20，其他各處理的病指均顯著低于CK1（表2）。其中，PGPR 菌株K03-4 和Pp146 對根腐病的防治效果分別達到了83.46%、68.31%，均高于50%多菌靈可濕性粉劑1 000 倍液對照組（CK2，53.15%）的防治效果，PGPR 菌株P(guān)p03-41 處理后也有接近50%的防治效果（49.02%）。

表2 3株P(guān)GPR細菌對丹參根腐病的防治效果Tab.2 Control effect of three PGPR strains on root rot of S.miltiorrhiza caused by F.proliferatum

2.6.2 促生作用評價 接種各PGPR 菌的發(fā)酵液60 d后，與無菌水對照組（CK1）比較，K03-4、Pp03-41和Pp146 處理組丹參的株高分別增加40.79%、43.86%、38.48%，莖葉鮮質(zhì)量分別增加90.41%、109.36%、105.90%，分根數(shù)分別增加133.61%、118.06%、162.61%，根鮮質(zhì)量分別增加74.23%、105.29%、125.87%（圖6、表3）。與KB 培養(yǎng)液對照組（CK2）比較，K03-4、Pp03-41 和Pp146 處理組丹參的株高分別增加29.77%、32.60%、27.64%，莖葉鮮質(zhì)量分別增加18.76%、30.57%、28.42%，分根數(shù)分別增加89.12%、76.53%、112.59%，根鮮質(zhì)量分別增加88.82%、122.49%、144.78%。盆栽試驗結(jié)果表明，PGPR 菌株K03-4、Pp03-41 和Pp146 均能極顯著提高丹參植株的株高、葉長、葉寬、分根數(shù)、莖葉鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量（表3）。根長方面，僅Pp146 處理后顯著高于對照。其中，Pp146 處理組根長、葉長、葉寬、分根數(shù)、根鮮質(zhì)量均為最高，Pp03-41處理組株高和莖葉鮮質(zhì)量最高。

圖6 3株P(guān)GPR細菌對丹參的促生效果Fig.6 Growth-promoting effect of three PGPR strains on S.miltiorrhiza

表3 3株P(guān)GPR細菌對丹參的促生指標統(tǒng)計Tab.3 Statistics of growth-promoting parameters of three PGPR strains on S.miltiorrhiza

續(xù)表3 3株P(guān)GPR細菌對丹參的促生指標統(tǒng)計Tab.3（Continued） Statistics of growth-promoting parameters of three PGPR strains on S.miltiorrhiza

3 結(jié)論與討論

近年來的研究表明，健康植物根部能夠富集大量PGPR 菌，可促進植物營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育和提高抗逆能力[18-23]，應(yīng)用PGPR 菌促進植物健康生長，從而降低化學(xué)農(nóng)藥和肥料投入已成為重要的研究方向。CHIALVA 等[24]的研究表明，與生長在基質(zhì)中的環(huán)境相比，原始土壤中的微生物能夠誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，進而提高番茄對土傳病害的抗性。本研究從野生丹參根際土壤中獲得66株拮抗菌，經(jīng)復(fù)篩和IAA 含量測定，篩選出K03-4、Pp03-41 和Pp146共3 株兼具生防和促生作用的高效PGPR 菌株，經(jīng)鑒定，其均為多黏類芽孢桿菌（P.polymyxa）。許樂等[25]從丹參根內(nèi)分離出1 株多黏類芽孢桿菌P.polymyxaDS-R5，對丹參根腐病有61.4%的防效，但未評價其促生作用。

本研究結(jié)果表明，K03-4 對丹參根腐病菌有66.15%的最高抑菌率，并對根腐病有83.46%的盆栽防治效果，Pp146 的IAA 含量最高且促進丹參根長、分根數(shù)和根鮮質(zhì)量增加最多，說明平板對峙試驗和IAA 含量檢測可作為篩選具有生防和根系促生作用PGPR 菌的方法。酶活性測定結(jié)果表明，K03-4 和Pp03-41 均可分泌蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶和纖維素酶，這些胞外水解酶是生防菌抑制多種植物病原真菌生長的重要物質(zhì)[26-27]，因此，K03-4 和Pp03-41可能是定殖在根部后通過降解根腐病菌細胞壁而發(fā)揮了生防作用。Pp146在平板對峙試驗中僅有48.21%的抑菌率，且不具備分泌β-1，3-葡聚糖酶和纖維素酶作用，但在盆栽試驗中卻有68.31%的防效，即Pp146 菌株對丹參根腐病的防治作用可能是通過與丹參的互作而使丹參產(chǎn)生了系統(tǒng)抗性。IAA 含量檢測結(jié)果為Pp146＞Pp03-41＞K03-4，根長和根鮮質(zhì)量測定結(jié)果也表現(xiàn)為Pp146＞Pp03-41＞K03-4，與已報到的IAA 具有促進作物根系生長的結(jié)論一致[13，28]。3 株P(guān)GPR 菌株能夠產(chǎn)嗜鐵素，并具有溶磷和固氮能力，推測3 個菌株的促長作用可能與其具有促進營養(yǎng)元素吸收的能力有關(guān)[29-30]。本研究獲得的K03-4、Pp03-41 和Pp146 共3 個PGPR 菌株防病、促生效果顯著，為丹參生物菌劑的開發(fā)利用提供了高效菌株。本研究未進行大田試驗，也未檢測丹參的藥效成分，下一步的研究中還需繼續(xù)開展相關(guān)工作，并對PGPR 菌的防病促生機制進行深入研究。