陳朝林，韓佃剛，楊云慶，張 沖，李 靜，羅倩敏，尹尚蓮，董仙蘭，李凌楓，師亞玲，艾 軍，信吉閣

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，昆明 650201；2.中華人民共和國昆明海關，昆明 650228）

藍舌?。˙luetongue，BT）是由呼腸孤科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Obivirus）藍舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的［1］，經(jīng)由庫朦屬吸血昆蟲叮咬傳播反芻動物、駱駝科動物的病毒性疫病，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須通報的動物疫?。?］。BTV 基因組由10 個雙鏈RNA 組成，包括大片段（L1-L3）、中片段（M4-M6）和小片段（S7-S10），共編碼7 個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP7）和4 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3a 和NS4）［3］。VP7 是由S7 基因編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由349 個氨基酸組成，位于病毒核衣殼的表面，呈三聚體結(jié)構(gòu)，約占核心蛋白總量的36%，是BTV 群特異性抗原蛋白之一，不同血清型之間的VP7 蛋白的同源性高達94%，通過對不同血清型VP7 蛋白的氨基酸序列比對得出，30～48 位氨基酸殘基的序列同源性為100%，證明VP7 蛋白為高度保守的蛋白，具有群特異性，是BTV 抗體檢測的理想抗原［4-7］。VP7 蛋白是血清群特異性的主要決定因素，大多數(shù)檢測BTV 的血清學檢測方法都是基于檢測抗VP7 抗體［8］。

昆蟲細胞表達系統(tǒng)是將外源目的基因插入桿狀病毒載體中，轉(zhuǎn)染入昆蟲細胞中對單個蛋白或者蛋白復合體進行高量表達的真核表達系統(tǒng)［9］。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達出的重組蛋白具有完整的生物學活性，適合生產(chǎn)和研發(fā)治療性抗體。目前已經(jīng)利用High Five 細胞、Sf9 細胞成功表達出商業(yè)化的人抗gp41 抗體3D6［10］。

課題組前期開發(fā)出基于昆蟲重組桿狀病毒表達BTV VP7 蛋白的藍舌病ELISA 抗體檢測試劑盒。為了優(yōu)化試劑盒生產(chǎn)工藝，進一步獲得高表達量的BTV VP7 蛋白，本研究開展了貼壁培養(yǎng)和搖瓶懸浮培養(yǎng)對昆蟲細胞中BTV VP7 蛋白表達量影響的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Sf9 昆蟲細胞、表達BTV VP7 蛋白的重組桿狀病毒Vbacmin-BTV-VP7、藍舌病B-ELISA 抗體檢測試劑盒（內(nèi)含HRP 標記的BTV VP7 單克隆抗體、ELISA板、pH 9.6 碳 酸 鹽 包 被 液、TMB 顯 色 液、1 mol/L H2SO4終止液、PBST 洗液）由昆明海關技術中心動物檢測實驗室提供；胎牛血清購自Biological Industries（BI）公司；Grace’s培養(yǎng)基購自Gibco 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

Sf9 細胞用含10%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基在27 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞感染重組桿狀病毒Vbacmin-BTV-VP7

1）待細胞長滿75 cm2細胞培養(yǎng)瓶后，將2 瓶細胞換液，每瓶加入20 mL Grace’s 培養(yǎng)基，將細胞吹打下來，混合到一起，細胞計數(shù)得7.7×105CFU/mL。

2）將40 mL 含細胞的培養(yǎng)液平均分到1 個175 cm2細胞培養(yǎng)瓶和1 個500 mL 搖瓶中，各加入8 mL含有重組桿狀病毒Vbacmin-BTV-VP7 的種子病毒貯存液，然后用含有2%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)總體積至每瓶80 mL。175 cm2細胞培養(yǎng)瓶放入27 ℃培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)，搖瓶放入27 ℃搖床中懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為60 r/min。培養(yǎng)5 d。

1.4 Sf9 細胞形態(tài)觀察及BTV VP7 蛋白表達量測定

培養(yǎng)第一至第五天，每天分別用顯微鏡觀察并拍照記錄兩種培養(yǎng)條件下Sf9 細胞的形態(tài)變化，無菌條件下分別從細胞培養(yǎng)瓶和搖瓶中吸取500 μL細胞培養(yǎng)基，裝于1.5 mL 的離心管中，用間接ELISA方法檢測BTV VP7 蛋白表達量。簡述如下：取不同方式培養(yǎng)的病毒液，用pH 9.6 碳酸鹽包被液1∶10 稀釋，每孔100 μL 包被ELISA 板，37 ℃作用1 h，洗板3次，將洗滌液拍干。每孔加100 μL 固定濃度HRP 標記的BTV VP7 單克隆抗體，37 ℃作用1 h，洗板3 次，將洗滌液拍干，TMB 顯色，1 mol/L H2SO4終止顯色，讀取450 nm 吸光度值（OD450nm）。根據(jù)OD450nm判定表達蛋白的含量，OD450nm大小與表達蛋白含量成正比，OD450nm越高間接反映蛋白表達量越高。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均數(shù)±標準差（x±s）表示。用Excel軟件制作折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞形態(tài)變化

由圖1 和圖2 可見，昆蟲細胞在轉(zhuǎn)染病毒的第一天，細胞形態(tài)為大小均勻的圓形，細胞透亮，折光性好，細胞數(shù)量較多。貼壁培養(yǎng)和搖瓶懸浮培養(yǎng)的細胞隨著BTV VP7 蛋白在細胞內(nèi)的增殖，細胞形態(tài)開始逐漸變化，一些細胞變大，出現(xiàn)細胞大小不均勻、細胞折光性變差的現(xiàn)象。第四天，細胞數(shù)量開始明顯減少，顯微鏡下可見具有完整細胞形態(tài)的細胞數(shù)量變少，出現(xiàn)很多細胞碎片。第五天，貼壁培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)的瓶內(nèi)只存在極少數(shù)的圓形細胞，其他均為非細胞形態(tài)的碎片。

圖2 貼壁培養(yǎng)第一至第五天昆蟲細胞形態(tài)對比（顯微鏡倍數(shù)20 倍）

2.2 BTV VP7 蛋白表達量測定

表1 為記錄第一天到第五天從細胞搖瓶中吸取的樣品測得的吸光度值。運用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)分析可知，初始濃度與第一、二天相比，差異顯著（P＜0.05）；第三天與第一、二、四、五天相比，差異顯著（P＜0.05）；第二、四、五天之間相比，差異不顯著（P＞0.05）。

表1 搖瓶培養(yǎng)重組桿狀病毒不同時間點BTV VP7蛋白含量（OD450 nm）

表2 為記錄第一天到第五天從貼壁培養(yǎng)瓶中吸取的樣品測得的吸光度值。第一、二、四、五天與初始濃度相比差異顯著（P＜0.05），第一、二、四、五天之間差異不顯著（P＞0.05），第三天和其他天數(shù)相比差異均顯著（P＜0.05）。

表2 貼壁培養(yǎng)重組桿狀病毒不同時間點BTV VP7蛋白含量（OD450 nm）

BTV VP7 蛋白表達量動態(tài)折線圖見圖3。由圖3 可知，BTV VP7 蛋白表達量從第一天到第三天處于增長期，從第二天到第三天BTV VP7 蛋白表達量顯著上升，從第三天到第四天BTV VP7 蛋白表達量下降迅速，第四天到第五天蛋白表達量變化微小。培養(yǎng)至第三天時貼壁培養(yǎng)的昆蟲細胞中BTV VP7蛋白表達量明顯高于搖瓶培養(yǎng)的蛋白表達量。

圖3 BTV VP7 蛋白表達量動態(tài)

3 小結(jié)與討論

BTV VP7 蛋白在貼壁培養(yǎng)的昆蟲細胞中的表達量高于搖瓶培養(yǎng)，且培養(yǎng)到第三天時BTV VP7 蛋白表達量最高。

藍舌病是一種嚴重危害綿羊養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的疫病。綿羊不分品種、性別和年齡都對藍舌病毒易感。病毒感染對羔羊的影響尤為明顯，如生長發(fā)育遲滯，甚至引起死亡；母羊感染會導致胎兒畸形等嚴重后果［11］。2019 年，有學者從污染疫苗批次中分離出一株新BTV 毒株，經(jīng)鑒定為血清28 型藍舌病病毒［12］。同年在很多國家和地區(qū)發(fā)生血清3 型藍舌病、血清4 型藍舌病、血清8 型藍舌病，總受影響動物14 萬只，感染動物2 800 只，死亡300 只。藍舌病病毒抵抗力較強，具有多個血清型，且各型之間交叉免疫性差，故只有制成多價疫苗，才能獲得可靠的保護作用［13］。為了控制BTV 的傳播，將經(jīng)濟損失降到最低，開展藍舌病疫苗研究、血清抗體監(jiān)測是一項非常重要的工作。

ELISA 是最常用的血清學檢測方法，20 世紀80年代國外已先后報道了BTV間接ELISA、阻斷ELISA、競爭性ELISA 檢測方法的建立［14］。本研究將重組桿狀病毒在昆蟲細胞上產(chǎn)生的BTV VP7 蛋白包被到ELISA 板上，利用固定濃度HRP 標記BTV VP7 單抗，采用間接ELISA 法評估BTV VP7 蛋白的表達量。結(jié)果表明，昆蟲細胞在貼壁培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)兩種培養(yǎng)條件下均在第三天時BTV VP7 蛋白表達量最高。從細胞形態(tài)變化可以看出第四到五天細胞數(shù)量明顯減少，細胞碎片增加。BTV VP7 在第一天到第二天侵染細胞、增殖、分泌蛋白，第三天細胞破碎，釋放出大量蛋白，因此第三天的蛋白表達量明顯增多，而第四天和第五天，由于大部分細胞已破碎，BTV VP7 蛋白表達量不再繼續(xù)升高。此外，BTV VP7 蛋白表達量下降，可能是由于某些原因?qū)е翨TV VP7 蛋白降解所致，具體降解原因有待進一步研究。貼壁培養(yǎng)的昆蟲細胞中BTV VP7 蛋白表達量更高，可能是由于貼壁培養(yǎng)單位體積提供細胞生長的表面積大，細胞密度更高，而搖瓶培養(yǎng)單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低。本試驗結(jié)果可為優(yōu)化昆蟲細胞中表達BTV VP7 蛋白的培養(yǎng)條件提供參考。