湯琳波，李富祥，邵慶勇，王金萍，樊月圓，高華峰

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 662400）

羊傳染性胸膜肺炎主要是由絲狀支原體山羊亞種（Mmc）、綿羊肺炎支原體（Movi）、山羊支原體山羊亞種（Mcc）和山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）等引起的在山羊或綿羊中普遍流行的接觸性傳染病[1-4]。該病在云南省冬春兩季最為常見，以發(fā)熱、咳嗽、喘氣、漸進(jìn)性消瘦、肺間質(zhì)性肺炎為主要病變特征。羊群感染后發(fā)病率較高，病程也較長，因此其對養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重危害。

由于羊傳染性胸膜肺炎的病原復(fù)雜，存在多種病原體，不同支原體及亞種致病性及毒力也存在較大差異。因此，加強(qiáng)病原監(jiān)測是控制本病的重要環(huán)節(jié)。對山羊傳染性胸膜肺炎病原監(jiān)測表明，Mmc 和Movi 是感染山羊的兩種優(yōu)勢支原體株，其中Mmc 檢出率較低，但致病性更強(qiáng)，Movi 檢出率較高，但感染后癥狀表現(xiàn)較輕[3]。伴隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)發(fā)展，關(guān)于羊傳染性胸膜肺炎在分子水平上的研究取得了長足進(jìn)展。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，Movi 16S rRNA 序列相似性較高，不同株同源性可達(dá)99.3%～99.9%，因此基于該基因的PCR 快速檢測方法能很好地完成病原檢測[7-9]。目前借助分子生物學(xué)技術(shù)，對病原檢測的方法已較為完善。但基于血清學(xué)方法對本病檢測及免疫評估仍缺乏相應(yīng)手段。現(xiàn)有研究[10]表明，Movi 熱休克蛋白（HSP70）及延伸因子（TU）具有較好的抗原性。2020 年冬季，本課題組從云南省昆明市某山羊養(yǎng)殖場分離到一株Movi，在完成形態(tài)學(xué)及16S rRNA 比對分析的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究分析了TU和HSP70兩種基因序列特征及抗原特性，以期為了解云南省Movi 病原學(xué)特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 2020 年冬季，由于氣候變化波動較大，云南省昆明市某山羊養(yǎng)殖場部分羊群發(fā)病。病羊初期表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂無光、有黏液性化膿性眼鼻分泌物、呼吸急促，羊群自然發(fā)病率為30%左右，但死亡率較低。從不同發(fā)病時期采集病羊鼻分泌物、死亡羊肺臟、扁桃體組織及胸腔積液，用于病原分離培養(yǎng)，同時采集康復(fù)期羊血清。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 支原體瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基CM0410B、支原體肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基CM0403B 及補(bǔ)充培養(yǎng)基SR0059C，均購自賽默飛公司，參照使用說明書配制使用。

1.1.3 主要試劑 原核表達(dá)載體pET-28a、大腸桿菌DH5α 菌株、大腸桿菌BL21 菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；2×PremixTaq、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、pMD18-T 載體、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒及DNA Marker 等分子生物學(xué)試劑，購自大連寶生物公司；IPTG 及蛋白Marker，購自Sigma 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，購自北京索萊寶公司；引物合成及測序，由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.4 樣品DNA 提取 參照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書，提取樣品及純培養(yǎng)物DNA 后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病羊臨床癥狀及病理剖檢觀察

觀察記錄羊發(fā)病過程臨床表現(xiàn)，并對死亡羊只進(jìn)行常規(guī)剖檢。

1.3 支原體分離純化

扁桃體及肺臟組織用含青霉素的雙蒸水清洗后研磨，再加入2 mL 液體篩選培養(yǎng)基增菌，2 000 r/min 離心5 min；取上清液接種至固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d；挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)物。

1.4 支原體樣品16S rRNA 檢測及鑒定

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒分別提取分泌物、組織樣品及分離純培養(yǎng)物的基因組DNA，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]合成Movi 及Mmc 16S rRNA 檢測引物（表1）。用上述引物對提取的基因組DNA 同時進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物分別為0.5 μL，模板2.0 μL，最后用滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共進(jìn)行35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測序，將所得序列與GenBank中16S rRNA 序列進(jìn)行比對驗(yàn)證。

表1 Movi 及Mmc 16S rRNA 擴(kuò)增引物信息

1.5 Movi HSP70 及TU 基因PCR 鑒定

分別設(shè)計(jì)2 對擴(kuò)增全長HSP70及TU基因序列的特異性引物（表2）。以病原分離培養(yǎng)中純培養(yǎng)的支原體基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物分別為1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，最后用滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接克隆載體pMD18-T，完成陽性鑒定后送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測序。將所得序列與GenBank 中參考序列進(jìn)行比對，并采用鄰接法（Neighbor Joining method，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 HSP70 及TU 基因擴(kuò)增引物信息

1.6 HSP70 及TU 基因生物信息學(xué)分析

將克隆所得HSP70及TU基因測序驗(yàn)證結(jié)果，與GenBank 收錄的支原體序列完成比對，利用MEGAX 軟件構(gòu)建NJ 進(jìn)化樹，分析Movi 分離株與其他株的親源關(guān)系，并利用DNAstar 軟件分析不同支原體序列核苷酸的同源性。

1.7 表達(dá)載體構(gòu)建及HSP70 及TU 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

對測序正確的克隆載體和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a分別進(jìn)行NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切，目的片段和載體膠回收后用T4 DNA 連接酶置于16 ℃過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，克隆經(jīng)PCR測序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細(xì)胞；將陽性單克隆接種LB 培養(yǎng)基，在OD600達(dá)到約0.6 時加入1 mol/L IPTG 誘導(dǎo)6 h，以12 000 r/min 離心5 min 收集表達(dá)菌體沉淀及上清。

1.8 蛋白染色及Western blot 分析

取40 μL 表達(dá)上清及經(jīng)超聲波裂解后的菌體，加入10 μL 5×SDS-PAGE loading Buffer 煮沸10 min并置于冰上，12 000 r/min 短暫離心后，取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；棄去濃縮膠，將分離膠放入考馬斯亮蘭染色液中過夜染色，煮沸脫色后完成凝膠成像。將完成電泳的樣品同時轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶封閉后加入康復(fù)期綿羊血清4 ℃孵育過夜，用PBST 洗凈，加入按1:2 000 比例稀釋后兔抗羊過氧化物酶標(biāo)記IgG，孵育1 h 后PBST 清洗，加入顯色底物完成顯色。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

該場羊只病例呈散發(fā)性，表現(xiàn)為冬季溫差較大時易發(fā)病，病程較長，發(fā)病率較高，但死亡率較低，以咳嗽、精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂、眼結(jié)膜潮紅、有黏液性化膿性眼鼻分泌物為主要癥狀。隨著病情加重，全群采食量下降，羊群自然發(fā)病率約為30%。治療后死亡病例少。剖檢病死羊發(fā)現(xiàn)，呼吸道及肺部出現(xiàn)典型病理變化，剖檢可見扁桃體腫大、化膿并充血，病程加長后鼻甲骨變形為典型癥狀，肺局部發(fā)生肉變，胸腔有少許紅色積液及黃色分泌物（圖1）。

2.2 支原體分離

將純化培養(yǎng)后的分離株接種至固體培養(yǎng)基，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d 后，可觀察到灰白色針尖狀大小菌落。挑取針尖狀培養(yǎng)物完成純培養(yǎng)，低倍顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，菌落呈“煎蛋樣”形態(tài)（圖2）。

2.3 16S rRNA PCR 鑒定及HSP70、TU 基因克隆

分離株純化后，將2 個單菌落分別接種于液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)；提取支原體基因組DNA，經(jīng)兩對16S rRNA 通用引物擴(kuò)增后獲得與預(yù)期相符的條帶，其大小為563 bp，二重PCR 未見Mmc 陽性擴(kuò)增（圖3-A）；擴(kuò)增條帶樣品測序后，經(jīng)BLAST 分析比對確定為Movi，并將其命名為YN-2020 株。完成陽性鑒定的單菌落經(jīng)HSP70及TU基因全長引物擴(kuò)增，結(jié)果顯示，TU基因擴(kuò)增大小為1 209 bp，HSP70基因擴(kuò)增大小為1 818 bp，均與預(yù)期大小相符（圖3-B、C）。

2.4 YN-2020 分離株遺傳進(jìn)化分析

Movi 分離株YN-2020TU基因全長經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T 連接轉(zhuǎn)化，涂板后經(jīng)PCR 完成陽性克隆篩選，測序驗(yàn)證確定序列信息。根據(jù)TU基因序列與GenBank 初步比對結(jié)果，從中選取具有代表性的14 株支原體序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，并完成核苷酸序列比對。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示：Movi 分離株YN-2020TU基因與Movi MoGH3-3 株親緣關(guān)系較近，與Movi 標(biāo)準(zhǔn)株Y98 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；在不同支原體種間，YN-2020TU基因與牛殊異支原體（Dispar）親緣關(guān)系較近，與禽滑液囊支原體（Synoviae）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4-A）。核苷酸序列比對結(jié)果顯示，其與Movi MoGH3-3 株同源性最高（98.2%），與發(fā)酵支原體（Fermentans）PG18 株同源性最低（72.8%）。

Movi 分離株YN-2020HSP70基因全長經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T 連接轉(zhuǎn)化，涂板后經(jīng)PCR 完成陽性克隆篩選，測序驗(yàn)證確定序列信息。根據(jù)HSP70基因序列與GenBank初步比對結(jié)果，從中選取具有代表性的15 株支原體序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，并完成核苷酸序列比對。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示：Movi YN-2020 分離株HSP70基因與Movi 117 株親緣關(guān)系較近，與Movi NCTC10151 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；在不同支原體種間，YN-2020HSP70基因與Dispar親緣關(guān)系較近，與豬鼻支原體（Hyorhinis）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4-B）。核苷酸序列比對結(jié)果顯示，其與Movi 117 株核苷酸同源性最高（99.4%），與HyorhinisHub-1 株同源性最低（80.1%）。

2.5 YN-2020 分離株TU 及HSP70 蛋白誘導(dǎo)及表達(dá)

對含有目的基因的重組質(zhì)粒和空表達(dá)載體pET-28a 雙酶切后，以T4 DNA 連接酶連接，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中完成表達(dá)克隆載體構(gòu)建，并將其分別命名為pET28a-rTU及pET28a-rHSP70。兩種重組菌落分別于20 ℃培養(yǎng)16 h 及37 ℃培養(yǎng)6 h（兩種蛋白均使用兩種溫度條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)），誘導(dǎo)后分別收集菌體沉淀及上清，菌體經(jīng)超聲破碎后，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳及免疫印跡檢測。染色結(jié)果顯示：表達(dá)載體pET28a-rTU 在20 ℃培養(yǎng)16 h 及37 ℃培養(yǎng)6 h 均能較高量表達(dá)TU 蛋白，誘導(dǎo)后TU 蛋白在上清中表達(dá)量低，在菌體沉淀中表達(dá)量高，重組蛋白大小約48.0 kDa，與預(yù)期大小一致（圖5-A、B）；表達(dá)載體pET28a-rHSP70 在20 ℃培養(yǎng)16 h 及37 ℃培養(yǎng)6 h 均能表達(dá)HSP70 蛋白，但在20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h 獲得的重組蛋白表達(dá)量較高，且在上清及菌體沉淀中均有表達(dá)，重組蛋白大小約68.0 kDa，與預(yù)期大小一致（圖6-A、B）。

3 討論

傳染性胸膜肺炎是由不同支原體引起的一類重要山羊和綿羊傳染病。該病廣泛分布于世界各主要山羊及綿羊養(yǎng)殖地區(qū)，尤其是亞洲和非洲國家。病原學(xué)和血清流行病學(xué)研究[1-3]表明，不同國家和地區(qū)羊群中流行的羊群感染支原體優(yōu)勢菌株存在較大差異。近年來，由支原體感染引起的傳染性胸膜肺炎在我國呈現(xiàn)增多趨勢，不同地區(qū)流行的羊傳染性胸膜肺炎主要由Movi 和Mmc 引起，兩種支原體的混合感染給疾病防控帶來了困難[1-5]。云南省病原監(jiān)測表明，這兩種支原體是最常見的優(yōu)勢菌種。流行病學(xué)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)：Mmc 檢出率低但致死率高；Movi 檢出率較高，部分未引起發(fā)病的羊場也能通過PCR 檢出，一旦有應(yīng)激因素如氣候激烈變化或發(fā)生基礎(chǔ)性疾病，就可能引發(fā)局部流行。單純由Movi 引起的羊群死亡率較低，多數(shù)病例伴隨細(xì)菌（如巴氏桿菌及鏈球菌）繼發(fā)感染，給本病防治增加了困難。

Movi 在云南省羊群中較高的陽性率以及帶來的防治成本增加，制約了肉羊養(yǎng)殖效益提高，因此需要強(qiáng)化病原學(xué)研究。本研究中，結(jié)合云南省部分羊場支原體病原監(jiān)測工作，采集病料完成了病理剖檢及病原檢測。病理剖檢表明，本次羊場羊只呼吸道感染疾病由Movi 引起，主要癥狀表現(xiàn)為扁桃體腫大及慢性肺炎。在上述工作的基礎(chǔ)上，完成了病原分離鑒定，并對YN-2020 分離株部分抗原基因進(jìn)行了基因特征及蛋白表達(dá)研究。遺傳進(jìn)化樹分析表明，分離株YN-2020TU及HSP70基因均存在一定程度變異，在與國內(nèi)外流行株比較中，TU基因與Movi MoGH3-3株核苷酸同源性最高（98.2%），與FermentansPG18 株同源性最低（72.8%）。HSP70基因則與Movi 117 株核苷酸同源性最高（99.4%），與HyorhinisHub-1 株核苷酸同源性最低（80.1%）。YN-2020 分離株與其他代表株相比，核苷酸同源性較高，兩種基因均較為保守，其中HSP70基因保守性高于TU基因。此外，兩種蛋白抗原性分析表明，兩種蛋白在Western blot 檢測中均與康復(fù)期綿羊血清有反應(yīng)性，提示表達(dá)蛋白具有良好的免疫原性。對兩種蛋白的結(jié)構(gòu)與功能仍需加深研究，以期指導(dǎo)未來生產(chǎn)實(shí)踐。