師亞玲，韓佃剛，董 俊，葉玲玲，李凌楓，陳朝林，信吉閣，艾 軍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2.昆明海關(guān)技術(shù) 中心，云南昆明 650200）

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的嚴(yán)重傳染病[1]，主要感染山羊、綿羊和野生小反芻動(dòng)物等[2]。該病在世界范圍內(nèi)備受重視，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[3-4]，在我國被列為一類動(dòng)物疫病[5]。

PPRV 屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，是不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 病毒，只有一個(gè)血清型[6]。該病毒基因組共編碼6 種結(jié)構(gòu)蛋白，依次為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L）[7-9]。其中N 蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白，可通過自我組裝成核衣殼粒子，與P 蛋白和L 蛋白協(xié)同作用調(diào)控病毒RNA 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[10]，是病毒粒子中含量最豐富且免疫原性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白[11]。PPRV 感染機(jī)體可以引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，因此N 蛋白常被作為建立診斷、檢測(cè)方法的候選抗原[12]。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus expression vector system，BEVS）是以桿狀病毒為載體，以昆蟲細(xì)胞為受體的高效真核表達(dá)系統(tǒng)[13]。該系統(tǒng)可將外源目的基因插入桿狀病毒載體中，轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞對(duì)單個(gè)蛋白或者蛋白復(fù)合體進(jìn)行高量表達(dá)[14]。

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)常用方式有貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，所需資金少，便于觀察細(xì)胞形態(tài)變化，是最常用且最穩(wěn)定的培養(yǎng)方式[15]。搖瓶懸浮培養(yǎng)的操作和培養(yǎng)條件也較為簡(jiǎn)單，具有病毒產(chǎn)量高、產(chǎn)出周期短、不易被污染等優(yōu)勢(shì)[16]。因此本研究選用這兩種方式作為重組桿狀病毒培養(yǎng)方式。

本課題組前期已開發(fā)出基于重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)PPRV N 蛋白的ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒。為優(yōu)化試劑盒生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步獲得高表達(dá)量的N蛋白，開展了貼壁培養(yǎng)和搖瓶懸浮培養(yǎng)對(duì)昆蟲細(xì)胞中PPRV N 蛋白表達(dá)量影響的研究，以期為優(yōu)化昆蟲細(xì)胞表達(dá)PRRV N 蛋白的培養(yǎng)條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Sf9 昆蟲細(xì)胞、表達(dá)PPRV N 蛋白的重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N、PPRV C-ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（內(nèi)含PPRV 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗、ELISA 板、pH9.6 碳酸鹽包被液、TMB顯色液、1 mol/L H2SO4終止液、PBST 洗液），均由昆明海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室提供；胎牛血清，購自Biological Industries（BI）公司；Grace's 培養(yǎng)基，購自Gibco 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Sf9 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的Grace's 培養(yǎng)基，在27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 感染Sf9 細(xì)胞

待Sf9 細(xì)胞在兩瓶75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿后，換液，每瓶?jī)?nèi)加入20 mL Grace's 培養(yǎng)基；將細(xì)胞吹打下來后混合到一起，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，密度為2.35×105個(gè)/mL（共40 mL）；將40 mL Sf9 細(xì)胞均分至175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶和500 mL 搖瓶中，各加入8 mL 含有重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 的種子病毒貯存液，然后用含2%胎牛血清的Grace′s 培養(yǎng)基將總體積添至80 mL/瓶；將175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶放 入27 ℃保溫箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，搖瓶放入轉(zhuǎn)速為60 r/min，溫度為27 ℃搖床中懸浮培養(yǎng)，總共培養(yǎng)120 h。

1.4 Sf9 細(xì)胞形態(tài)觀察及N 蛋白表達(dá)量測(cè)定

1.4.1 Sf9 細(xì)胞形態(tài)觀察 培養(yǎng)后24、48、72、96、120 h，分別用顯微鏡觀察并拍照記錄兩種培養(yǎng)條件下Sf9 細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4.2 N 蛋白表達(dá)量測(cè)定 病毒培養(yǎng)24、48、72、96、120 h 后，在無菌條件下分別從細(xì)胞培養(yǎng)瓶和搖 瓶中吸取500 μL 病毒培養(yǎng)液，同時(shí)吸取500 μL 重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 種子病毒液作為對(duì)照，分別裝于1.5 mL 離心管中，用間接ELISA 檢測(cè)PPRV N 蛋白表達(dá)量。每個(gè)樣品做8 個(gè)重復(fù)，最后的數(shù)值取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）。具體步驟：將吸取的病毒液，用pH9.6 碳酸鹽包被液按體積比1:10 進(jìn)行稀釋；每孔加入100 μL 稀釋液包被ELISA 板，37 ℃作用1 h，洗板3 次，將洗滌液拍干；在ELISA 板中每孔加入100 μL 固定濃度PPRV 單克隆抗體，37 ℃作用1 h，洗板3 次，將洗滌液拍干；在ELISA 板中每孔加入100 μL 固定濃度HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37 ℃作用1 h，洗板3 次，將洗滌液拍干；以TMB 顯色，1 mol/L H2SO4終止顯色，讀取450 nm 吸光值（OD450nm）。根據(jù)OD450nm判定PPRV N 蛋白表達(dá)量，OD450nm大小與表達(dá)蛋白含量成正比，OD450nm越高間接反映蛋白表達(dá)量越高。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以x±SD 表示，采用方差Duncan法分析不同培養(yǎng)時(shí)間蛋白表達(dá)量之間的差異顯著性，用Excel 軟件制作折線圖。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng) 感染重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 后，Sf9 細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)形態(tài)隨時(shí)間變化如圖1。結(jié)果顯示：在感染重組桿狀病毒后24～48 h，Sf9 細(xì)胞形態(tài)為大小均勻的圓形，細(xì)胞透亮，折光性好，細(xì)胞數(shù)量較多；72 h 后，Sf9 細(xì)胞隨著PPRV N 蛋白在胞內(nèi)累積，細(xì)胞形態(tài)開始逐漸變化，一些細(xì)胞變大，出現(xiàn)細(xì)胞大小不均勻現(xiàn)象，細(xì)胞折光性變差；從感染后96 h開始，顯微鏡下具有完整形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)細(xì)胞碎片；至感染后120 h，細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)只存在少數(shù)圓形細(xì)胞和大部分非細(xì)胞形態(tài)碎片。

2.1.2 搖瓶懸浮培養(yǎng) 感染重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 后，Sf9 細(xì)胞在搖瓶中懸浮培養(yǎng)形態(tài)隨時(shí)間變化如圖2。結(jié)果顯示：在感染重組桿狀病毒后24～48 h，Sf9 細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則為圓形，細(xì)胞透亮，折光性好，細(xì)胞數(shù)量較多；隨著N 蛋白在胞內(nèi)累積，細(xì)胞形態(tài)逐漸變化，細(xì)胞大小變得不均勻，折光性變差，數(shù)量逐漸減少；至72～96 h，形態(tài)完整可見的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)很多細(xì)胞碎片；感染后120 h，只可見到極少數(shù)的圓形細(xì)胞，其他均為非細(xì)胞形態(tài)碎片。

2.2 PPRV N 蛋白表達(dá)量測(cè)定

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng) 表1 記錄了病毒培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)（24～120 h）從貼壁培養(yǎng)細(xì)胞瓶中吸取的樣品和重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 種子病毒液測(cè)得的吸光度值（OD450nm）。由SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可知，種子病毒液中N 蛋白含量與培養(yǎng)后24、48 h 表達(dá)N 蛋白量相比，無顯著性差異（P＞0.05）；培養(yǎng)72 h 與48 h 相比，N 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；培養(yǎng)96 h 與72 h 相比，蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；培養(yǎng)120 h 與96 h 相比，蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；蛋白表達(dá)量從培養(yǎng)后48 h 開始快速增長(zhǎng)，到120 h 時(shí)達(dá)到高峰。

表1 貼壁培養(yǎng)重組桿狀病毒不同時(shí)間點(diǎn)PRRV N 蛋白表達(dá)量（吸光度值測(cè)定）

2.2.2 搖瓶懸浮培養(yǎng) 表2 記錄了病毒培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)（24～120 h）從懸浮培養(yǎng)搖瓶中吸取的樣品和重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 種子病毒液測(cè)得的吸光度值（OD450nm）。根據(jù)數(shù)據(jù)分析可知，種子病毒液中N 蛋白含量與培養(yǎng)后24、48 h 相比，無顯著性差異（P＞0.05）；培養(yǎng)72 h 與48 h 相比，蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；培養(yǎng)96 h 與72 h、120 h 相比，蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；N 蛋白從第48 h 開始快速增長(zhǎng)，到96 h 蛋白表達(dá)量達(dá)到最高峰，120 h 蛋白表達(dá)量開始下降。

表2 懸浮培養(yǎng)重組桿狀病毒不同時(shí)間點(diǎn)PRRV N 蛋白表達(dá)量（吸光度值測(cè)定）

2.2.3 不同培養(yǎng)條件下N 蛋白表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化比較 由圖3 可知，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)和搖瓶懸浮培養(yǎng)條件下，PRRV N 蛋白表達(dá)量在培養(yǎng)24～48 h時(shí)均變化不大，48～120 h 時(shí)顯著上升；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，96 h 搖瓶懸浮培養(yǎng)條件下N 蛋白表達(dá)量高于貼壁培養(yǎng)，120 h 二者趨于一致。

3 討論

PPR 是由PPRV 引起的小反芻動(dòng)物的臨床以發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為主要特征的一種急性高度接觸性傳染病。感染后，羊的發(fā)病率和病死率分別高達(dá)100%和90%[17]。PPR 傳入我國后，對(duì)西南邊境省份的養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[18]。本研究基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)于原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)（表達(dá)外源蛋白時(shí)具有完備的翻譯后加工修飾能力）[19]，開展了PPRV N 蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)量的有關(guān)分析，可為后續(xù)建立基于N 蛋白的PPRV檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

ELISA 是最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法。20 世紀(jì)80 年代，國外已先后報(bào)道了藍(lán)舌病病毒間接ELISA、阻斷ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 檢測(cè)方法的建立[20]。本研究是將重組桿狀病毒在Sf9 昆蟲細(xì)胞上表達(dá)的PPRV N 蛋白包被到ELISA 板上，使用固定濃度的PPRV 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗，評(píng)估N 蛋白表達(dá)量。從圖3 可以看出，昆蟲細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)兩種條件下，二者達(dá)到表達(dá)量最高的時(shí)間不同。Sf9 昆蟲細(xì)胞形態(tài)變化顯示，培養(yǎng)96～120 h 細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞碎片增加。推測(cè)過程為重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 在培養(yǎng)24～48 h 時(shí)侵染細(xì)胞，然后病毒增殖，表達(dá)N 蛋白，在72 h 時(shí)部分細(xì)胞破碎，釋放出大量N 蛋白，因此72 h 時(shí)蛋白表達(dá)量明顯增多，而96 h 和120 h 后，破碎的細(xì)胞更多，搖瓶懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)量在96 h 達(dá)到最高峰，120 h蛋白表達(dá)量開始下降；貼壁培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)量在120 h 達(dá)到最高峰。搖瓶培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中N 蛋白96 h 表達(dá)量更高，則可能是由于搖瓶培養(yǎng)的細(xì)胞與重組桿狀病毒Vbacmin-PPRV-N 的接觸面積更大，細(xì)胞更容易被感染，也更容易破碎，從而釋放出大量N 蛋白。本研究可為優(yōu)化昆蟲細(xì)胞表達(dá)PRRV N 蛋白的培養(yǎng)條件提供參考。