王 翠，許宗麗，黃溢泓，覃艷然，梁競(jìng)臻，周師師，劉針伶，黃小武，馬小蓉，李志源，嚴(yán)斯剛

（柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545005）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染豬引起的一種熱性急性傳染性疫病，臨床癥狀表現(xiàn)為體溫高熱、皮膚充血、多器官出血及流產(chǎn)等癥狀[1]。ASFV 是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridate）的唯一一種病毒，也是唯一一種蟲(chóng)媒傳播的雙鏈線性DNA 病毒，以直接或間接接觸以及軟蜱吸血途徑傳播，僅感染豬科動(dòng)物（不同生長(zhǎng)階段、品種的豬均易感）[2]。ASFV 是大型、似六角形、復(fù)雜的二十面體帶囊膜的雙鏈線性DNA 病毒，直徑172～260 nm，基因組全長(zhǎng)170～194 kb，其病毒顆粒是由3 萬(wàn)余個(gè)蛋白亞基，17 280 種蛋白質(zhì)組裝成的球形顆粒，是目前解析近原子分辨率結(jié)構(gòu)中最大的病毒顆粒[3]。ASFV 根據(jù)病毒是否具有紅細(xì)胞吸附特性，已鑒定出8 個(gè)血清群，依據(jù)編碼p72 蛋白的B646L基因的3′端序列，目前全球已鑒定出至少24 種基因型，其中歐洲流行I 型和II 型[4]。強(qiáng)毒力基因II 型2018 年傳入我國(guó)，隨后蔓延至全國(guó)，2021 年2 月Sun 等[5]在我國(guó)發(fā)現(xiàn)基因II 型自然低毒力毒株，其基因序列發(fā)生了不同程度的突變或缺失，導(dǎo)致毒株致病性降低，有明顯的殘留毒力，引起的臨床癥狀也具有明顯的隱蔽性；2021 年10 月Sun 等[6]從山東和河南兩省豬場(chǎng)臨床發(fā)病豬樣品分離出兩株基因I 型毒株，經(jīng)動(dòng)物攻擊試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出低毒力和有效傳播能力，并可導(dǎo)致輕度感染和慢性疾病，而感染這些低毒力毒株的豬不斷排出病毒并出現(xiàn)低水平的病毒血癥，排毒及病毒血癥規(guī)律性較差，這給ASF 的早期診斷和防控帶來(lái)巨大障礙。為更好地給ASF 早期診斷和防控提供幫助，就當(dāng)前的ASFV 病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)行了概述。

1 活病毒檢測(cè)

活病毒檢測(cè)主要有病毒分離（virus isolation，VI）和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（hemadsorption，HAD）。VI 鑒定結(jié)合HAD 是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）確診ASF 的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。VI 是將ASFV 從豬血液、肺（肺泡）單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中分離出來(lái)，鏡下觀察是否有細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）；HAD 是根據(jù)紅細(xì)胞聚集在ASFV 感染的巨噬細(xì)胞周?chē)?，觀察細(xì)胞表面是否有“玫瑰花環(huán)”或“桑葚狀”現(xiàn)象[7]。但這些方法試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，所需設(shè)備昂貴，對(duì)技術(shù)人員素質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室生物安全條件等方面要求較高，必須在具有生物安全三級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，且目前只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室能從事ASFV 分離、鑒定、活病毒培養(yǎng)、動(dòng)物接種試驗(yàn)等，因此并不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，通常適用于ASFV 致病機(jī)制和分子生物學(xué)表征的研究及疫苗的研發(fā)。

ASFV 分離最早使用豬原代巨噬細(xì)胞，且必須是豬身上的新鮮分離的血液才行，而大多數(shù)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室通常是不易獲得的。Rai 等[8]從非洲綠猴腎上皮細(xì)胞中分離到商業(yè)化的細(xì)胞系MA-104（猴胚胎腎細(xì)胞），能從不是新鮮的血液樣品中檢測(cè)ASFV，其靈敏度與原代豬巨噬細(xì)胞相當(dāng)。近期又有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，ASFV 能在ZMAC-4（胎豬肺巨噬細(xì)胞）、WSL（野豬肺細(xì)胞）和IPKM（豬腎巨噬細(xì)胞）中高效復(fù)制，這些可替代的細(xì)胞能節(jié)省大量的前置時(shí)間。而1963 年Tubiash 等[10]在西班牙首次發(fā)現(xiàn)ASFV 不吸附紅細(xì)胞。2021 年Sun 等[5]在我國(guó)分離出22 株自然變異株，其中有11 株因基因突變或缺失阻止病毒翻譯完整的CD2v 蛋白，導(dǎo)致病毒粒子失去吸附紅細(xì)胞表型的能力。因此，不具有紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的ASFV 毒株，并不適用于此方法來(lái)進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步確診需要對(duì)病毒分離培養(yǎng)物采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等方法進(jìn)行檢測(cè)鑒定。

2 病毒核酸檢測(cè)

病毒核酸檢測(cè)是針對(duì)ASFV 核酸序列的，常用方法有PCR、qPCR、微流控芯片法、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其中PCR 和qPCR 是OIE 推薦的首選確診技術(shù)。不同方法有其各自的特點(diǎn)，具體見(jiàn)表1。

表1 常用ASFV 核酸檢測(cè)方法比較

2.1 PCR

從發(fā)明到現(xiàn)在，PCR 方法被不斷改進(jìn)和優(yōu)化，已成為實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)常用方法之一，也是OIE推薦的ASF 診斷方法之一。Agüero 等[11]針對(duì)編碼p72 蛋白的B646L基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了ASFV PCR 檢測(cè)方法。該方法擴(kuò)增片段大小為257 bp，使用的引物是OIE 推薦使用的引物之一。為了建立一種便捷、快速且精準(zhǔn)的ASFV 檢測(cè)方法，李艷等[12]根據(jù)ASFV p72 蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了ASFV 鎖核酸修飾引物PCR 檢測(cè)方法。該方法具有良好的敏感性和特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)3×101copies/μL，比常規(guī)PCR 方法提高了100 倍，比qPCR 方法提高了10 倍。用該方法檢測(cè)了72 份臨床樣品，其結(jié)果與OIE 推薦的qPCR 方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%。

因動(dòng)物疫病的復(fù)雜化，ASFV 多與其他病原混合感染，引起的臨床癥狀不典型，無(wú)法與其他疫病區(qū)別。為了快速診斷豬只感染狀況，Liu 等[13]針對(duì)ASFV、豬瘟病毒和非典型豬瘟病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了3 對(duì)特異性引物，建立多重PCR 檢測(cè)方法用于臨床樣本的鑒別診斷。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，且對(duì)樣品保存方式要求較低，但對(duì)技術(shù)人員操作要求高，不適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.2 qPCR

相比于普通PCR，qPCR 在普通PCR 基礎(chǔ)上引入了光譜技術(shù)，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化，定量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR 反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程，最后通過(guò)擴(kuò)增曲線和反應(yīng)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量（Ct）來(lái)判斷樣品的陰陽(yáng)性。該方法的特異性、靈敏性都超過(guò)普通PCR，且自動(dòng)化程度高，不易污染，是目前公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)之一。

為了防止基因錯(cuò)配而導(dǎo)致檢測(cè)不準(zhǔn)確，Yang等[14]針對(duì)B646L和B438L基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)了2組特異性引物和2 個(gè)TaqMan 熒光探針建立了雙重qPCR。該方法的檢測(cè)限為10 copies/μL。用180 份ASFV 臨床感染樣本，將其與商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果兩種方法具有良好的一致性（98.3%），因而該方法可以極大提高ASFV 檢測(cè)效率。為了鑒別檢測(cè)ASFV 的野生型毒株和基因缺失毒株，韓勇軍等[15]根據(jù)ASFV 的P72、CD2v、MGF360-14L基因保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)上述4 種基因的多重?zé)晒舛縋CR 方法。該方法的最低檢測(cè)限為100 copies/mL。用該方法與ASFV 核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)35 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性符合率為100%。該方法的建立對(duì)ASFV 的鑒別檢測(cè)、病原流行病學(xué)調(diào)查等具有重要意義。為了快速檢測(cè)出越南ASFV 流行毒株，Trinh 等[16]針對(duì)編碼p54 蛋白的E183L基因建立一種新型qPCR 方法。該方法檢測(cè)限為2.63 copies/μL，能夠檢測(cè)根據(jù)P72基因分型的I、II 和V 的15 種不同ASFV 參考毒株，為ASF 防控提供了一種新的檢測(cè)方法。

qPCR 檢測(cè)技術(shù)靈敏，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性，所以對(duì)于PCR 實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)根據(jù)條件實(shí)施試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)等分區(qū)管理，同時(shí)也要注意由于引物和探針的錯(cuò)配及選擇的試劑盒不夠敏感等原因?qū)е碌募訇幮越Y(jié)果，所以一次檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性結(jié)果均需謹(jǐn)慎評(píng)價(jià)，最終確診需結(jié)合臨床和流行病學(xué)指標(biāo)，必要時(shí)可采取基因測(cè)序或者其他平行試驗(yàn)[17]。

2.3 微流控芯片法

微流控芯片技術(shù)是將樣品前處理、反應(yīng)、分離及檢測(cè)等過(guò)程集成到幾平方厘米的芯片上，自動(dòng)完成分析全過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了分析微型化、自動(dòng)化、集成化和便攜化的一種新技術(shù)[18-19]。Jia 等[20]針對(duì)ASFV 的B646L基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，結(jié)合探針建立了納米微流控?cái)?shù)字PCR。該方法的檢測(cè)限為30.19 copies/mL，比OIE 推薦的qPCR 高約33 倍。用該方法與OIE 推薦的qPCR 同時(shí)檢測(cè)69份滅活的臨床血清樣本，發(fā)現(xiàn)兩種方法具有良好的一致性（91.30%）。為評(píng)估微流控芯片法在ASFV核酸快速檢測(cè)中的效果，邵靚等[21]用ASFV 微流控芯片快速檢測(cè)試劑盒和市場(chǎng)上ASFV qPCR 檢測(cè)試劑盒，對(duì)43 份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)微流控芯片法可以在15～30 min 內(nèi)檢出，最低檢出限為2.5 copies/uL，與qPCR 具有良好的一致性（97.67%）。該方法具有樣品消耗少、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，但需要特定的設(shè)備，檢測(cè)成本高，難以被推廣。

2.4 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新興的分子生物學(xué)核酸檢測(cè)方法，有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplif ication，LAMP）、重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（recombinase polymerase amplif ication，RPA）、重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（recombinase aided amplif ication，RAA）和酶促重組酶擴(kuò)增（enzymatic recombinase amplif ication，ERA）4 種。等溫條件下，在特異性引物、酶等物質(zhì)的作用下實(shí)現(xiàn)體外核酸擴(kuò)增，再結(jié)合瓊脂凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光和測(cè)流層析試紙條以及規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（clustered stered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）4 種方式，可呈現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果。Yang 等[22]針對(duì)p72 蛋白基因建立了LAMP 結(jié)合CRISPR Cas12a 系統(tǒng)的ASFV 便攜式檢測(cè)方法，檢測(cè)限可達(dá)7 copies/μL，檢測(cè)時(shí)間只需30 min；反應(yīng)結(jié)束后可在藍(lán)光（440～485 nm）下肉眼觀察到熒光，與臨床樣本的qPCR 檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。Ceruti 等[23]基于ASFV p72 蛋白編碼基因B646L建立了RPA 檢測(cè)方法，該方法只需42 ℃反應(yīng)15 min，最低檢測(cè)限為3.5 copies/μL，與qPCR 具有較好的一致性。為了節(jié)約時(shí)間和耗材以及方便基層人員和應(yīng)急情況下的檢測(cè)，Wang 等[24]將RPA與側(cè)流技術(shù)相結(jié)合，建立了一種用于ASFV 定點(diǎn)診斷的金納米顆粒試紙條，稱(chēng)其為側(cè)流基因檢測(cè)（lateral f low gene assay，LFGA）。LFGA 在反應(yīng)溫度較低（37～42 ℃）、反應(yīng)時(shí)間較短（30 min）的條件下，能特異性識(shí)別ASFV 和豬瘟病毒感染血樣中的ASFV，檢測(cè)限可達(dá)102copies/μL，與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果相當(dāng)。LFGA 實(shí)現(xiàn)了快速RPA 擴(kuò)增后產(chǎn)物的可視化觀察，整個(gè)過(guò)程不需要任何昂貴的儀器，使ASFV 在有限的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)了點(diǎn)對(duì)點(diǎn)診斷。為了克服傳統(tǒng)診斷方法耗時(shí)長(zhǎng)、要求高、不直觀等缺點(diǎn)，F(xiàn)u 等[25]針對(duì)p72 蛋白基因建立RPACas12a 熒光檢測(cè)法用于ASFV 的定點(diǎn)檢測(cè)，其最低檢測(cè)限7 copies/μL，20 min 內(nèi)即可進(jìn)行可視化檢測(cè)。曾宇晨等[26]根據(jù)ASFVB646L、EP402R基因和多基因家族成員MGF360/505基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性的ERA 探針和引物，建立了42 ℃等溫條件下檢測(cè)ASFV 的ERA 方法，對(duì)應(yīng)基因建立的3種檢測(cè)方法分別在16、7 和13 min 內(nèi)即可得出檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)下限均為102copies/μL，特異性強(qiáng)。用該方法與我國(guó)現(xiàn)行ASF 診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中的方法對(duì)比，結(jié)果符合率為100%，從而為流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種快速有效的檢測(cè)方法。等溫?cái)U(kuò)增方法具有操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備、檢測(cè)時(shí)間短、成本低、攜帶方便、靈敏度高等特點(diǎn)，可在等溫條件下快速進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因而為ASF防控提供了一種快速、直觀的檢測(cè)手段。

3 抗原檢測(cè)

抗原檢測(cè)是針對(duì)ASFV 的結(jié)構(gòu)蛋白而建立的一種檢測(cè)方法。該方法基于抗原抗體反應(yīng)的基本原理，通過(guò)制備針對(duì)特定抗原表位的特異性抗體，在體外與病毒蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物，從而對(duì)樣品中ASFV 的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，能夠在發(fā)病早期和急性感染的窗口期檢測(cè)到病毒。目前，抗原檢測(cè)常用的方法有熒光抗體試驗(yàn)、夾心ELISA 抗原檢測(cè)、高敏免疫熒光分析法、免疫層析試紙條等。

3.1 熒光抗體試驗(yàn)

ASFV 熒光抗體試驗(yàn)（f luorescent antibody test，F(xiàn)AT）可用于檢測(cè)可疑豬組織樣品中的病毒抗原。該方法被OIE 列為ASF 的輔助診斷方法，用于病毒分離和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)，能夠區(qū)分ASFV 和其他病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變，及對(duì)“非紅細(xì)胞吸附”ASFV 感染豬進(jìn)行檢測(cè)，但FAT 對(duì)熒光素標(biāo)記的抗原特異性要求較高，非特異性的熒光素染色會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。此外該方法對(duì)亞急性和慢性ASF 檢出率低，僅為40%，但對(duì)早期急性ASF 病例檢出率高[27]。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)，但對(duì)人員要求較高，需要熒光顯微鏡以及必須在相應(yīng)的生物安全三級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[27]。

3.2 夾心ELISA 抗原檢測(cè)

夾心ELISA 是將特異性抗體作為固相包被在96 孔板中，再加入待檢樣品及酶標(biāo)抗體孵育后顯色，從而可對(duì)樣品進(jìn)行定性或定量的一種方法。我國(guó)現(xiàn)行的ASF 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中是以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的ASFV p30 蛋白單抗作包被抗體，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。而目前已有的商品試劑盒是西班牙INGEASA 公司的ASFV 抗原檢測(cè)ELISA 試劑盒（DAS-ELISA）。Gallardo 等[28]用該試劑盒對(duì)277 份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，與qPCR 相比較檢測(cè)的敏感性為77.2%。張麗[27]制備了兩株p54 蛋白單克隆抗體，命名為2E8 和HRP-6D8，基于這兩種單克隆抗體建立了ASFV 雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)方法。該方法與DAS-ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率為91.8%（134/146）。該方法操作較為簡(jiǎn)便、快速、成本較低，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，較于抗體檢測(cè)而言，可以更早地檢出ASFV 感染，適用于對(duì)ASF的高通量檢測(cè)和早期快速篩查，特別是對(duì)于早期急性型ASF 的診斷敏感性較高。而對(duì)于亞急性型和慢性型ASFV 感染，由于抗原-抗體復(fù)合物的存在，該方法的特異性及靈敏性稍低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此，目前抗原ELISA 應(yīng)與OIE 推薦的診斷技術(shù)結(jié)合使用，而較早開(kāi)發(fā)一種快速、敏感、特異的ASFV 抗原ELISA 檢測(cè)方法對(duì)ASF 防控極其重要。

3.3 高敏熒光免疫分析法

高敏熒光免疫分析法是一種將獨(dú)特的鑭系元素和免疫學(xué)反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線對(duì)待檢樣品濃度進(jìn)行定量檢測(cè)的新型檢測(cè)技術(shù)。我國(guó)現(xiàn)行的ASF 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是以鑭系元素螯合物為熒光信號(hào)與抗原抗體免疫層析技術(shù)結(jié)合起來(lái)檢測(cè)ASFV 抗原。Chen 等[29]利用Eu3+-螯合物標(biāo)記制備的p30 單克隆抗體建立了一種檢測(cè)ASFV 的時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved f luorescence immunoassay，TRFIA），最低檢測(cè)限為0.015 ng/mL，檢測(cè)線性范圍為0.24～500.00 ng/mL，室溫下只需45 min 即可得到結(jié)果，與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)使用的LAMP 同時(shí)檢測(cè)125 份豬鼻液，兩者結(jié)果一致。TRFIA 具有較高的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，為養(yǎng)豬業(yè)快速篩查ASF 提供了一種新方法。

3.4 膠體金免疫層析試紙條

膠體金免疫層析試驗(yàn)（colloidal gold-based immunochromatographic assay，GICA）是將膠體金標(biāo)記后的抗待測(cè)物抗體的標(biāo)記物顆粒固定于玻璃纖維上，同時(shí)在硝酸纖維素膜上固定特異性抗體和抗抗體，分別作為檢測(cè)帶（test line）和質(zhì)控帶（control line），當(dāng)試紙條插入檢測(cè)樣品時(shí)，抗原與抗體反應(yīng)導(dǎo)致大量膠體金顆粒的聚集，進(jìn)而呈現(xiàn)顯色反應(yīng)[30]。

為滿(mǎn)足基層實(shí)驗(yàn)室或屠宰場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)ASFV 的檢測(cè)需求，王之瑩[31]等針對(duì)ASFV p72蛋白基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并與膠體金試紙條技術(shù)結(jié)合，建立了一種低成本檢測(cè)ASFV 的側(cè)流核酸測(cè)定試紙條（lateral f low nucleic acid assay，LFNAA）。該方法能夠在2 h 內(nèi)肉眼鑒定出結(jié)果，與中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心認(rèn)可的ASFV 檢測(cè)試劑盒的靈敏度相一致，均能達(dá)到103copies/uL。鄔旭龍等[32]針對(duì)ASFV pK205R 蛋白制備了兔抗多克隆抗體，建立了ASFV 膠體金檢測(cè)試紙條，其最佳標(biāo)記量約為40 μg/mL，T 線捕獲抗原的抗體標(biāo)記最適質(zhì)量濃度約為1.5 mg/mL，質(zhì)控C 線標(biāo)記最適質(zhì)量濃度約為2 mg/mL，最小檢測(cè)量為30～40 ng/mL。該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，反應(yīng)條帶清晰可見(jiàn)，且具有較高的檢測(cè)特異性，為臨床檢測(cè)的推廣和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。Zhang等[33]制備了兩株針對(duì)ASFV 磷蛋白P30 的單克隆抗體，分別命名為3H7A7 和6H9A10，并基于這2株單克隆抗體建立了用于快速檢測(cè)ASFV 的膠體金試紙條，檢出限為2.16 ng，檢測(cè)153 份臨床現(xiàn)場(chǎng)樣本（包括血清、血漿、組織和抗凝血處理過(guò)的血液），其結(jié)果與qPCR 的一致性為95.42%，為基層、現(xiàn)場(chǎng)快速篩選可疑感染豬供了一種方便、快捷、簡(jiǎn)單的檢測(cè)技術(shù)，有利于在現(xiàn)場(chǎng)基層推廣使用。

該方法使用方便，操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍廣泛，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不需要特定的儀器設(shè)備與試劑，且結(jié)果判定非常直觀，因而對(duì)基層檢測(cè)ASFV 非常適用。但是由于膠體金標(biāo)記物的不穩(wěn)定性和靈敏度不高，在判定時(shí)只能給出定性或者半定量的結(jié)果，因此更快研制出新型標(biāo)記物的免疫層析試紙用于ASF 基層防控尤為重要。

4 小結(jié)

自2018 年ASF 傳入我國(guó)已3 年有余。ASFV存活時(shí)間長(zhǎng)、抵抗力強(qiáng)，基因組龐大、易變異，感染后抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，甚至可以終生攜帶抗體，截至目前仍無(wú)商業(yè)化疫苗可用，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。為了有效防控ASF，前期的快速檢測(cè)/監(jiān)測(cè)和豬場(chǎng)生物安全管理尤為重要。OIE 推薦的病原檢測(cè)方法包括病毒分離、FAT以及PCR方法。病毒分離和紅細(xì)胞吸附耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，通常只有被參考實(shí)驗(yàn)室采用；對(duì)于病毒核酸檢測(cè)，普通PCR 和qPCR 是OIE 推薦的首選診斷方法，其特異性和靈敏度均較高，但操作復(fù)雜、成本高；等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本低、不需要特殊儀器、檢測(cè)時(shí)間短、成本低、攜帶方便、靈敏度高，最適用于屠宰場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但因特異性不高，而靈敏度過(guò)高易出現(xiàn)假陽(yáng)性，需要不斷地更新和改進(jìn)；微流控芯片法具有樣品消耗少、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，但因檢測(cè)成本高和需要特定的設(shè)備未得到廣泛使用；抗原檢測(cè)技術(shù)FAT 對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；夾心ELISA 和膠體金免疫試紙條快速、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低，但敏感性和特異性還需改進(jìn)。

綜上所述，ASF 病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)雖很成熟，但各有優(yōu)缺點(diǎn)，所以應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況結(jié)合使用。此外，近年來(lái)市面上有各種檢測(cè)試劑盒，但這些試劑盒的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，因缺乏大數(shù)據(jù)無(wú)法得到證實(shí)，需要按照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估和驗(yàn)證，以確保其特異性、靈敏度、精確度和穩(wěn)定性，從而為基層正確選擇試劑盒提供依據(jù)。