趙麗娜，王一碩，張振凌

(1.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學院，鄭州 451460；2.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450008)

丹參作為一味中藥，為歷代醫(yī)家所推崇，“一味丹參散，功同四物湯”，指出其在治療心血管疾病中具有重要的地位。丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根及根莖，其主要功效為活血化瘀，調(diào)經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰[1]。裕丹參，俗名血參，是傳統(tǒng)中藥材丹參的一種，其品質(zhì)優(yōu)異，療效顯著，古時因產(chǎn)于河南南陽裕州(今為河南南陽方城縣)而馳名。方城縣地理位置特殊，正處于桐柏山脈與伏牛山脈、淮河流域與長江流域、北亞熱帶與南暖溫帶的分界線上，氣候環(huán)境獨特，孕育出的裕丹參具有枝條粗壯、顏色紫紅、品質(zhì)優(yōu)、療效好等特點，被醫(yī)圣張仲景稱為“丹參之首”。丹參的有效成分包括脂溶性成分(二萜醌類)和水溶性成分(酚酸類)，均具有一定的生理活性[2]。2020版《中國藥典》丹參項下脂溶性成分以丹參酮類成分作為質(zhì)控指標[1]，包括丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ，因此本文以丹參酮類成分作為丹參脂溶性成分的代表研究其動態(tài)積累規(guī)律，為確定裕丹參最佳采收日期和產(chǎn)地加工方法，制定裕丹參藥材種植標準操作規(guī)程提供科學依據(jù)。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津)，Agilent SB-C18(4.6×250mm)；BS210S型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；AUW120D分析天平(日本島津)；DHG—9076A型恒溫鼓風干燥箱(上海屹堯科技有限公司)；KQ-500DV型超聲波清洗器(世安科技股份有限公司)；SC-1000Y高速粉碎機(上海尚層科技有限公司)。

1.2 試劑

本實驗所采用的實驗用水為二次去離子水，具體實驗試劑信息見下表1。

表1 試劑信息

1.3 藥材

本實驗所用裕丹參樣品來源于河南省南陽市方城縣華豐中藥材有限公司裕丹參種植基地，經(jīng)過河南中醫(yī)藥大學中藥學科專家鑒定為雙子葉植物唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。

2 實驗方法與供試品溶液的制備

2.1 色譜條件

本實驗采用C18色譜柱；柱溫為20℃，檢測波長為270 nm；流動相A為乙腈，流動相B為0.02%磷酸溶液，按下表2中色譜條件的規(guī)定進行梯度洗脫。

表2 色譜條件

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定丹參酮IIA對照品0.2mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

將丹參樣品粉末粉碎后過三號篩，精密稱定0.3g，置具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，密閉，稱定重量后，超聲處理(功率140W，頻率42kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密吸取上述對照品貯備溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，加入高效液相色譜儀自動進樣系統(tǒng)，依次進樣，測定峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(Y)，以進樣體積(μL)為橫坐標(X)，進行回歸分析，回歸方程Y=114825X-59067，R2=0.9993。結(jié)果表明丹參酮ⅡA在4～14 μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 丹參酮IIA標準曲線制備

圖1 丹參酮IIA的標準曲線

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液10μL，于0、2、4、8、16h加入高效液相色譜儀自動進樣系統(tǒng)，自動進樣，測定丹參酮ⅡA的含量，RSD為0.92%，表示溶液在16h內(nèi)供試品溶液保持穩(wěn)定。

2.6 重復性

取同一批次樣品5份，按照上述樣品的制備方法的方法制備溶液，進樣量為10μL，加入高效液相色譜儀自動進樣系統(tǒng)，自動進樣，測定丹參酮ⅡA的含量，RSD為1.02%，結(jié)果表明重復性較好。

2.7 中間精密度試驗

取同一樣品，在不同時間，不同分析人員進行樣品測定，進樣量為10μL，加入高效液相色譜儀自動進樣系統(tǒng)，自動進樣，測定丹參酮ⅡA的含量，RSD為0.75%，結(jié)果表明精密度較好。

2.8 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，加入高效液相色譜儀自動進樣系統(tǒng)，進行自動進樣，測定結(jié)果以丹參酮ⅡA對照品為參照，以其相應的峰為S峰，計算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的相對保留時間，相對保留時間及校正因子見表4，其相對保留時間應在規(guī)定值的±5%以內(nèi)。以丹參酮ⅡA的峰面積為對照，分別乘以校正因子，計算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量。

表4 相對保留時間及校正因子

3 不同產(chǎn)地加工方法對丹參中酮類成分的影響

3.1 樣品處理

參考有關(guān)文獻記載[3-4]，將同一批新鮮丹參藥材除去泥沙，剪掉須根和莖葉，混勻，分成等份進行了如下處理曬干、陰干、鮮切、發(fā)汗處理。具體處理方法見表5。

表5 不同干燥方法

3.2 含量測定

參照“2實驗方法”項下色譜條件、供試品溶液的制備及樣品測定，對不同產(chǎn)地加工方法處理的丹參各供試品溶液，按照色譜條件，測定供試藥材中丹參酮ⅡA的含量，從而根據(jù)校正因子計算出隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，再計算出丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的總量，結(jié)果見表6。

表6 不同加工方法丹參酮類成分含量

3.3 結(jié)果分析

實驗結(jié)果表明，丹參酮ⅡA在曬干法處理中含量偏低。在陰干、鮮切、直接發(fā)汗等無光照條件下含量較高，這是由于丹參酮ⅡA的化學性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光容易分解。實驗證明丹參的最適宜炮制加工工藝應以陰干法為主，但是缺點也很明顯，就是所耗費的時間較長，因此本次實驗采用低溫烘干法處理鮮丹參藥材。

4 不同生長時間對丹參中酮類成分的影響

4.1 樣品采集

本實驗所用裕丹參樣品來源于河南省南陽市方城縣華豐中藥材有限公司裕丹參種植基地，經(jīng)過河南中醫(yī)藥大學中藥學科專家鑒定為雙子葉植物唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。從丹參育苗開始計算生長時間，分別于8月齡、9月齡、10月齡、11月齡、一年、一年半、二年、二年半采集丹參藥材樣品。

4.2 樣品處理

根據(jù)“3 不同產(chǎn)地加工方法對丹參中酮類成分的影響”優(yōu)選的實驗條件，將采集的新鮮丹參藥材分別經(jīng)低溫烘干至含水量在30%時，搶水洗后直接切厚片，低溫烘干。

4.3 含量測定

參照“2 實驗方法”項下色譜條件、供試品溶液的制備及樣品測定，對不同生長時間采集處理的丹參各供試品溶液，按照色譜條件，測定供試藥材中丹參酮ⅡA的含量，從而根據(jù)校正因子計算出隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，再計算出丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的總量，結(jié)果見表7，圖2。

表7 不同采收日期裕丹參中酮類成分的含量

圖2 不同生長時期裕丹參中酮類成分含量變化趨勢

5 討論

本實驗將丹參藥材分別采用曬干、陰干、鮮切、直接發(fā)汗進行相應的加工處理，通過測定丹參酮類成分含量比較不同產(chǎn)地加工方法對丹參有效成分產(chǎn)生的影響。經(jīng)本實驗的數(shù)據(jù)比較，丹參酮ⅡA在陰干、鮮切、直接發(fā)汗等無光照條件下含量較高，這是由于丹參酮ⅡA是丹參中主要的脂溶性有效成分，但性質(zhì)不穩(wěn)定，在高溫或光照條件下易分解[5]，丹參產(chǎn)地加工工藝應以陰干法為主，但是缺點也很明顯，就是所耗費的時間較長，建議采用低溫烘干法加工丹參藥材。丹參藥材搶水洗可較好的除去表面泥土，保證藥材的潔凈度，減少有害重金屬的污染。搶水洗對丹參酮類成分影響不大，但對水溶性成分如酚酸類有一定的降低作用。有些文獻記載，加工丹參時，除去泥土，但忌用水洗。中國藥典中也沒有規(guī)定泥土應如何除去。根據(jù)產(chǎn)地加工多年的經(jīng)驗主要采取干燥后抖掉泥土，也有將藥材集中堆放，采用淋水除去表面泥土，但這種方法顯然很影響質(zhì)量，嚴重者會導致發(fā)霉變質(zhì)。因此，關(guān)于丹參的產(chǎn)地加工、除去泥土的方法等還有待進一步考察研究，本實驗根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗采用搶水法除去泥沙后，切片，烘干，并采用低溫烘干機，控制溫度在30～40℃。使用烘干機不僅可以快速使藥材烘干，而且溫度比較可控且均一，可有效控制藥材的質(zhì)量，故而避免了一般烘房控溫時因受人為因素影響較多而引起藥材質(zhì)量的變化。實驗中所使用的丹參藥材是河南省南陽市栽培的藥材，已經(jīng)過多次的良種選育，質(zhì)量優(yōu)異，是目前市場上銷售的主要丹參品種之一。根據(jù)《中國藥典》(2020版)規(guī)定，丹參按干燥品計算，含丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的總量不得少于0.25%。

本實驗結(jié)果表明裕丹參中酮類成分的總量在1%左右，是藥典含量的4倍，也進一步證明了河南產(chǎn)裕丹參藥材的品質(zhì)。通過對不同生長時期裕丹參中酮類成分含量的分析，結(jié)果表明裕丹參中丹參酮類成分在不同生長時期，含量變化較大，兩者均在生長一年半后，每年11月份達含量的最高峰。因此，在確定丹參的采收期時必須綜合考慮，在丹參規(guī)?；a(chǎn)地加工及生產(chǎn)過程中，尤其在試行趁鮮切制加工過程中，必須進行規(guī)范操作，制定嚴格的GAP管理制度，才能保證藥材的質(zhì)量和療效。丹參中丹參酮ⅡA和隱丹參酮的含量隨著生長時間的推移，波動性較大，但兩種成分變化趨勢十分相似，這可能與植物的生長周期和這兩種物質(zhì)的合成途徑有關(guān)，有待進一步研究。近幾年來學者對丹參中丹酚酸類成分所具有的藥理作用正在進一步研究中[6-7]其可能對肝腎具有保護作用等。所以，丹參中酚酸類成分的藥理活性研究對于增進人體健康、防治疾病等方面至關(guān)重要。本實驗后續(xù)還應進一步充分研究丹參中酚酸類化學物質(zhì)的變化規(guī)律，以期對丹參藥材不同產(chǎn)地加工方法與炮制一體化工藝研究[8-10]提供相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。