魏曉雪, 石 峰, 陳子熙, 馮劍豐, 2, 朱 琳

三角褐指藻及其藻際細(xì)菌對不同無機(jī)氮源的響應(yīng)

魏曉雪1, 石 峰3, 陳子熙4, 馮劍豐1, 2, 朱 琳1

(1. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 天津 300350; 2. 天津市跨介質(zhì)復(fù)合污染環(huán)境治理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300350; 3. 科技部科技評估中心, 北京 100081; 4. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院, 廣東 深圳 518060)

海洋生態(tài)系統(tǒng)中, 浮游植物和細(xì)菌之間的相互作用是影響營養(yǎng)鹽供應(yīng)和再生、海洋初級生產(chǎn)力和生物地球化學(xué)循環(huán)的基本生態(tài)關(guān)系。為研究營養(yǎng)鹽、浮游植物和細(xì)菌之間的關(guān)系, 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)條件下, 通過改變氮源的形態(tài)(硝態(tài)氮和銨態(tài)氮)和濃度, 研究海洋浮游植物三角褐指藻()的藻際細(xì)菌在不同營養(yǎng)條件下的響應(yīng)。通過測定不同體系中的無機(jī)氮濃度、藻體內(nèi)氮濃度和三角褐指藻及其藻際細(xì)菌的生物量變化, 探討了藻-菌生物量變化的差異以及氮濃度和藻生長的關(guān)系; 采用二代高通量測序(16S rDNA)的方法分析了三角褐指藻生長過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 具有分泌銨態(tài)氮促進(jìn)藻類生長功能的噬甲基菌屬()和海桿菌屬()細(xì)菌相對豐度在高濃度(溶液中無機(jī)氮濃度為500 μmol/L)組中均會(huì)隨時(shí)間的增加而減少。不同培養(yǎng)體系下, 促進(jìn)三角褐指藻生長的氮源主要來自實(shí)驗(yàn)初期外部無機(jī)氮的添加, 并且所有處理組中外部氮消耗率和藻體內(nèi)氮的增長率近似相等, 說明在本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)體系中藻際細(xì)菌雖然會(huì)對不同培養(yǎng)條件有所響應(yīng), 但對三角褐指藻的生長影響較小。

銨態(tài)氮; 硝態(tài)氮; 三角褐指藻; 藻菌關(guān)系

氮作為地球大氣層中最豐富的元素, 具有氧化還原活性, 可以參與生物體的呼吸能量代謝, 也可以與碳形成通用的共價(jià)鍵, 參與氨基酸和核苷酸的合成, 因而其為構(gòu)成生命體的必需元素之一[1-2]。由于海洋中的生物固氮過程在一定程度上是一個(gè)相對限制的過程[3], 即氮在海洋環(huán)境中供不應(yīng)求, 因此, 與其他營養(yǎng)元素相比, 氮經(jīng)常是主要的限制性資源[4]。而氮循環(huán)作為組成海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)中重要循環(huán)之一, 對維持和修復(fù)海洋生態(tài)平衡具有重要意義[5]。

浮游植物和細(xì)菌之間的生態(tài)關(guān)系作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生物間聯(lián)系之一, 可以對氮循環(huán)產(chǎn)生重要影響, 并通過串聯(lián)自下而上的生態(tài)效應(yīng)調(diào)節(jié)海洋系統(tǒng)的初級生產(chǎn)力和食物網(wǎng)的穩(wěn)定性[6]。浮游植物通過分泌有機(jī)分子在其周圍形成藻際環(huán)境, 生存于藻際環(huán)境的細(xì)菌被稱為藻際細(xì)菌[6]。藻際細(xì)菌依賴具有光合作用的浮游植物固定的有機(jī)碳維持生長, 其消耗量占浮游植物固定量的50%; 反之, 浮游植物依靠藻際細(xì)菌的礦化作用維持生長, 即藻際細(xì)菌將有機(jī)物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)物, 以供浮游植物利用[7]。最近很多研究發(fā)現(xiàn), 浮游植物和藻際細(xì)菌之間的關(guān)系是一個(gè)更為復(fù)雜的體系。二者之間的相互作用涉及輔助因子、微量元素、常量元素、蛋白質(zhì)和信號分子等物質(zhì)交換, 而這種交換可以促進(jìn)二者之間形成競爭、拮抗、互利共生和偏利共生的關(guān)系。例如, 藻際細(xì)菌和浮游植物可以通過對無機(jī)營養(yǎng)鹽的競爭, 進(jìn)而限制對方生長[8]。則是通過接觸硅藻細(xì)胞表面或抑制細(xì)胞分裂, 從而使硅藻細(xì)胞伸長、細(xì)胞質(zhì)體增加, 進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。已有研究表明浮游植物和藻際細(xì)菌之間的共生關(guān)系是由細(xì)菌分泌的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié), 該種營養(yǎng)物質(zhì)也可以促進(jìn)浮游植物的生長, 雖然這種現(xiàn)象的潛在原因仍在探究[10]。Amin等[11]將SA11菌種和多列擬菱形藻()在硝態(tài)氮過飽和的條件下混合培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)SA11菌種可以吸收硝態(tài)氮, 分泌銨態(tài)氮, 以供藻類利用;更易利用細(xì)菌分泌的銨態(tài)氮維持生長, 而不是外部添加的硝態(tài)氮。但是, 細(xì)菌分泌的銨態(tài)氮并不是促進(jìn)生長的主要影響因子。與硝態(tài)氮相比, 藻類對銨態(tài)氮的吸收耗能較少, 因此, 當(dāng)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮同時(shí)存在時(shí), 藻類更易利用銨態(tài)氮[12]。

綜上所述, 藻菌關(guān)系極其復(fù)雜, 但難以徹底分離。截至目前為止, 藻菌分離方法一般采用輔助方法(如渦旋、超聲處理和添加表面活性劑)、分離方法(如微量移液、過濾、離心分離等)和消殺方法(如抗生素、抗菌劑處理、紫外線照射等)相結(jié)合的方式[13]。這些分離方法可能對細(xì)胞造成損傷, 并且分離后的無菌微藻仍可能存在細(xì)菌[13]。

近年來, 有關(guān)研究營養(yǎng)鹽、浮游植物、細(xì)菌三者之間的關(guān)系越來越多, 有學(xué)者采用無菌的微藻和人工添加的單一菌種作為研究對象。雖然用可控的二者進(jìn)行研究是較好的實(shí)驗(yàn)方法, 但與藻菌的實(shí)際狀態(tài)相比, 這種條件下做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍有差異; 而且在分離過程中受到損傷的微藻細(xì)胞也可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響[13]。此外, 室內(nèi)培養(yǎng)的藻菌共棲體系因其體系穩(wěn)定, 種類豐富、營養(yǎng)充足且無外源生物干擾, 被同領(lǐng)域?qū)W者認(rèn)可并廣泛使用[11, 14-15]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明在藻菌體系中化學(xué)作用在無機(jī)氮轉(zhuǎn)化方面不顯著[15], 但該體系中藻際細(xì)菌在無機(jī)氮轉(zhuǎn)化方面的作用以及對浮游植物生長的影響仍不清楚。

本文通過室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn), 在不同形態(tài)、不同濃度無機(jī)氮條件下, 研究藻際細(xì)菌可能產(chǎn)生的影響, 以期了解該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街形⑸镌跓o機(jī)氮轉(zhuǎn)化方面的作用或響應(yīng), 為進(jìn)一步探究該體系中營養(yǎng)鹽、浮游植物、細(xì)菌三者之間的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻種、菌種及培養(yǎng)條件

選用海水模式生物三角褐指藻()作為實(shí)驗(yàn)藻種, 購自中國科學(xué)院海藻種質(zhì)庫, 藻種編號MASCC17, 該藻種分離自我國黃海海域, 未經(jīng)任何無菌處理。細(xì)菌為三角褐指藻原有藻際細(xì)菌, 并且在本次實(shí)驗(yàn)中未添加菌種或?qū)ζ溥M(jìn)行特殊處理。用人工海水[16]和改良f/2培養(yǎng)基[17]培養(yǎng)至對數(shù)生長期后饑餓3 d開始接種, 其初始密度為8×104個(gè)/mL。該藻種的培養(yǎng)和整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均按海洋監(jiān)測規(guī)范[18]中生物試驗(yàn)要求在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行, 以防止外部細(xì)菌的污染。

所有實(shí)驗(yàn)組均采用滅菌的人工海水和改良f/2培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液, 其中氮源及其濃度設(shè)置如表1所示。低濃度組中單一氮源的濃度依據(jù)研究不同無機(jī)氮源條件對藻類生長影響的相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)置[19]; 低濃度組中硝態(tài)氮-銨態(tài)氮的濃度設(shè)置是模擬近海海水的總無機(jī)氮濃度; 其混合比例(4︰1)是根據(jù)近海海水中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮一般比例設(shè)置[20]。由于低濃度組中單一氮源和混合氮源處理組研究目的不一樣, 即單一氮源體系是為了探究實(shí)驗(yàn)環(huán)境下低氮條件對藻類生長的影響, 而混合氮源體系是為了模擬實(shí)際海水環(huán)境, 因而其濃度設(shè)計(jì)不一樣。參考實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果[15], 確定500 μmol/L為本培養(yǎng)條件下最適三角褐指藻生長的氮摩爾濃度(下文稱“氮濃度”), 因此將其作為高濃度組的初始氮濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行, 所有處理組和空白對照組均以1 000 mL錐形玻璃瓶為培養(yǎng)容器, 置于人工氣候箱(BIC-400, 上海博迅)中培養(yǎng), 溫度為(22±1)℃, 培養(yǎng)體積為880 mL, 光照周期為12(L)︰12(D), 光照強(qiáng)度為110 μmol·m–2·s–1, 每天定時(shí)搖瓶3～4次, 并隨機(jī)變換三角瓶的位置。從接種初始日起, 每隔2 d測定一次藻、菌生物量, 同時(shí)測定培養(yǎng)液氮濃度以及藻體內(nèi)氮濃度, 直至氮源耗盡, 共計(jì)12 d。

表1 培養(yǎng)體系

1.2 生物量計(jì)數(shù)

三角褐指藻及其藻際細(xì)菌的生物量計(jì)數(shù)采用SYBR Green I(InvitrogenTM, USA)染色, 流式細(xì)胞儀(Accuri C6 Plus, BD)計(jì)數(shù)的方法[21]。

1.3 培養(yǎng)體系中無機(jī)氮濃度測定

取適量藻液, 先用0.22 μm濾膜過濾, 濾液用于培養(yǎng)液中無機(jī)氮濃度的測定。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的測定方法分別選用《海洋調(diào)查規(guī)范》的次溴酸鈉氧化法和鋅鎘還原法[22]。

1.4 藻體內(nèi)氮濃度測定

將100 mL藻液過濾(低氣壓)在孔徑0.7 μm的GF/F(Whatman, UK)膜(預(yù)先經(jīng)450 ℃過夜煅燒, 每個(gè)樣品一個(gè)膜, 膜用于測定經(jīng)分離所得藻細(xì)胞的氮含量)上, 然后用去離子水洗3次, 60 ℃烘干30 min后存于–23 ℃待分析, 用元素分析儀(EURO EA3000, Leeman)測定三角褐指藻體內(nèi)氮含量[23], 為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性, 每個(gè)樣品至少上機(jī)測2次, 保證其誤差小于10%。據(jù)藻體內(nèi)氮含量和藻生物量計(jì)算藻體內(nèi)氮濃度(nitrogen concentration in algae, NCA)。為得到所添加氮的質(zhì)量平衡結(jié)果, 即計(jì)算實(shí)際有多少氮被藻吸收, 因此藻體內(nèi)氮濃度用每升培養(yǎng)液中三角褐指藻所有細(xì)胞內(nèi)含氮量來表示, 其計(jì)算公式如下所示:

式中,a為藻體內(nèi)氮濃度(μmol/L),為三角褐指藻體內(nèi)氮含量(pg/個(gè)),a為藻生物量(個(gè)/mL),為氮的摩爾質(zhì)量(g/mol)。

1.5 細(xì)菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)三角褐指藻的生長階段, 分別取第0、4、8 和12 d的藻液。將其過濾在0.22 μm的聚碳酸酯膜(Merck Millipore, DE)上, 用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析。分析方法采用二代高通量測序[15], 測序平臺(tái)為Illumina HiSeq2500平臺(tái)(北京諾禾致源科技股份有限公司), 測序區(qū)域?yàn)?6S rDNA V4區(qū)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

差異分析使用IBM公司SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),<0.05表示顯著性差異。藻、菌生物量相關(guān)性分析使用R 3.1.1的“mgcv”包進(jìn)行廣義加性模型(generalized additive models, GAMs)擬合[24]。由于GAMs模型對不同變量之間的相互關(guān)系沒有限定, 因而適于描述自然環(huán)境中復(fù)雜的生態(tài)關(guān)系, 是一種較靈活預(yù)測變量之間相關(guān)性的有效工具[25]。本文通過對數(shù)轉(zhuǎn)換將藻、菌生物量歸一化后, 帶入GAMs模型, 其公式如下所示:

式中,為截距,1為非參數(shù)光滑樣條函數(shù),為機(jī)誤差項(xiàng)[24]。我們可以從模型結(jié)果中獲得值,<0.01表示顯著相關(guān)。

根據(jù)質(zhì)量守恒定律, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期(從第0 d到第12 d)內(nèi)溶液中無機(jī)氮總消耗量(公式3)和藻體內(nèi)氮元素總增長量(公式4)的計(jì)算公式如下所示:

式中, Δs為溶液中無機(jī)氮的總消耗量(mg), Δa為藻體內(nèi)氮含量的總增長量(mg);p為不同處理組中無機(jī)氮的初始濃度(μmol/L),ap為不同處理組中藻體內(nèi)氮的初始濃度(μmol/L);p為不同處理組中溶液的初始體積(L);C為不同處理組中第0、2、4、6、8、10、12 d溶液的無機(jī)氮濃度(μmol/L),ai為不同處理組中第0、2、4、6、8、10、12 d的藻體內(nèi)氮濃度(μmol/L);V為不同處理組中第0、2、4、6、8、10、12 d用于測定藻、菌生物量、溶液中無機(jī)氮濃度、藻體內(nèi)氮濃度和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)所需溶液的總體積(L);r為不同處理組中無機(jī)氮的最終濃度(μmol/L),ar為不同處理組中藻體內(nèi)氮的最終濃度(μmol/L);r為不同處理組中溶液的最終體積(L),為氮的摩爾質(zhì)量(g/mol)。

2 結(jié)果和討論

2.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

不同處理組中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨培養(yǎng)時(shí)間變化的情況如圖1所示。雙歧桿菌()屬于放線菌門, 噬甲基菌屬()、埃希氏桿菌屬()、大洋柄菌屬()、海桿菌屬()、琥珀酸弧菌屬()、海命菌屬()都屬于變形菌門, 韋榮氏球菌屬()、屬于厚壁菌門。由圖1可見, 該培養(yǎng)體系細(xì)菌的優(yōu)勢屬屬于變形菌門, 這與之前研究硅藻藻際環(huán)境的優(yōu)勢菌種為變形菌門的結(jié)果一致[10, 26]。

圖1 不同樣品在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)熱圖

注: 熱度圖中的列代表不同樣本, LN0、LN4、LN8、LN12分別是LN處理組第0 d、4 d、8 d和12 d的藻液樣品; 其他樣品縮寫詞含義依此類推。行代表群落結(jié)構(gòu), 顏色塊代表物種的相對豐度值(由紅棕到紫, 相對豐度逐漸升高), 只顯示豐度最高的前9個(gè)屬, 剩余的合并成“其他”

由圖1結(jié)果可知, 同一氮濃度不同氮形態(tài)處理組間, 所有細(xì)菌相對豐度在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上均無顯著差異(>0.05)。同一形態(tài)不同氮濃度未對屬于放線菌門、厚壁菌門的細(xì)菌以及變形菌門中、、和屬細(xì)菌相對豐度產(chǎn)生顯著影響(>0.05), 但和屬細(xì)菌相對豐度存在較大差異(<0.05)。具體而言, 單一添加硝態(tài)氮的處理組間,屬和屬細(xì)菌相對豐度高濃度實(shí)驗(yàn)組比低濃度組分別減少了約0.6%～5.5%和21%～25%; 單一添加銨態(tài)氮的處理組間,屬和屬細(xì)菌相對豐度高濃度比低濃度組分別減少了約2.6%～4.1%和6.1%～18%; 以1︰1比例混合添加硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的處理組間,屬和屬細(xì)菌相對豐度高濃度比低濃度組分別減少了約1.4%～5.1%和2%～ 18%; 以4︰1比例混合添加硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的處理組間,屬和屬細(xì)菌相對豐度高濃度比低濃度組分別減少了約1.9%～5.4%和4%～18%。說明在本實(shí)驗(yàn)體系中氮濃度的改變對部分細(xì)菌相對豐度的影響較明顯, 氮形態(tài)的改變對其影響較小。由于低濃度組處于氮限制(即相對于培養(yǎng)液中的其他元素, 氮處于相對不足的狀態(tài))狀態(tài), 而氮限制可以在一定程度上增強(qiáng)藻類合成胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)的能力[27], 許多研究表明EPS可能在很大程度上影響藻際環(huán)境微生物的豐度, 進(jìn)而影響其群落結(jié)構(gòu)[28]。而屬中度嗜鹽性甲基營養(yǎng)菌[29]和屬[30]細(xì)菌均可以參與海洋中含碳、氮或磷的無機(jī)和有機(jī)化合物的吸收、代謝, 在氮限制狀態(tài)下, 其可能為藻類提供生長所需的營養(yǎng), 造成這兩種細(xì)菌相對豐度發(fā)生變化。

在時(shí)間尺度上, 所有處理組中屬于放線菌門和厚壁菌門的細(xì)菌相對豐度均未產(chǎn)生明顯變化(> 0.05), 變形菌門中和屬細(xì)菌相對豐度也未產(chǎn)生明顯變化(>0.05), 而、、和屬細(xì)菌相對豐度在高濃度組中均會(huì)隨時(shí)間產(chǎn)生變化(<0.05), 即隨時(shí)間的增加, 高濃度組中屬相對豐度的平均值從1.6%增加至4.8%, 而、和屬的平均值則分別從7.4%、2.8%和42.0%減少至5.2%、1.6%和26.0%。在低濃度組中未發(fā)現(xiàn)明顯變化(>0.05)。上述現(xiàn)象可能是由于不同種類的細(xì)菌對不同氮源的敏感性不同, 藻類對不同氮源的利用方式也不同, 因而形成不同類型的藻菌關(guān)系。造成在不同無機(jī)氮源條件下, 細(xì)菌的相對豐度在時(shí)間尺度上的變化程度不同[6]。研究表明,屬細(xì)菌不僅參與合成維生素B族(如B1、B7和B12), 而且在碳限制或寡營養(yǎng)條件下可以有效地吸收水體中的磷元素, 并且它與cf.藻的生長也密切相關(guān)[31]。屬細(xì)菌也可以產(chǎn)生B12[32]和分泌與鐵具有極高親和性的有機(jī)小分子[14], 并且具有可以直接將硝態(tài)氮還原為銨態(tài)氮, 即硝酸鹽異化還原銨(dis-similatory nitrate reduction to ammonium, DNRA)的代謝作用[33], 以供藻類生長利用。段露露等[34]發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌促進(jìn)藻類生長時(shí), 細(xì)菌豐度會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化; 并且細(xì)菌生物量不同, 其對藻類生長的影響也不同。在高濃度處理組中、、和屬細(xì)菌可能分泌利于藻類生長的物質(zhì), 因而其相對豐度隨時(shí)間發(fā)生變化; 由于低濃度處理組細(xì)菌的生物量較小, 其可能未對藻類產(chǎn)生影響或影響較小, 因而低濃度組細(xì)菌相對豐度未隨時(shí)間發(fā)生明顯變化。

2.2 不同培養(yǎng)條件下三角褐指藻及藻際細(xì)菌生物量的變化

不同處理組中三角褐指藻的藻際細(xì)菌生物量隨時(shí)間的變化如圖2所示。由于培養(yǎng)體系中的細(xì)菌為三角褐指藻原有藻際細(xì)菌, 其初始數(shù)量不易控制, 因此第0 d的細(xì)菌在不同處理組中其生物量存在差異。與對照組相比, 高濃度組和低濃度組菌的生物量顯著增加(<0.05); 其中高濃度組的細(xì)菌生物量是對照組的6～10倍, HN、HA、HNA(1︰1)、HNA(4︰1)處理組中細(xì)菌的最大生物量分別為1.85×106個(gè)/mL、2.61×106個(gè)/ mL、2.80×106個(gè)/mL和3.38×106個(gè)/mL; 低濃度組的細(xì)菌生物量是對照組的2～3倍, LN、LA、LNA(1︰1)、LNA(4︰1)處理組中細(xì)菌的最大生物量分別為1.17× 106個(gè)/mL、1.12×106個(gè)/mL、6.52×105個(gè)/mL和8.65× 105個(gè)/mL。并且, 隨著初始添加的無機(jī)氮濃度的增加, 細(xì)菌生物量的增加幅度也隨之升高; 即與對照組相比, 初始添加無機(jī)氮濃度為40 μmol/L、88.2 μmol/L和500 μmol/L的培養(yǎng)體系中細(xì)菌的生物量分別增加了1.3、2.5和7.2倍。說明培養(yǎng)體系中無機(jī)氮濃度可能影響菌的生長狀況, 但也可能是三角褐指藻的生長影響細(xì)菌生物量的變化。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)在同一培養(yǎng)條件下藻菌共培養(yǎng)體系的細(xì)菌總生物量顯著高于無藻培養(yǎng)體系, 并且細(xì)菌的生長均與藻類生長保持一致, 因而在一定程度上, 三角褐指藻分泌的胞外產(chǎn)物影響該培養(yǎng)體系中藻際細(xì)菌的生長, 即藻的存在影響細(xì)菌的豐度變化[15]。主要原因是所采用的f/2培養(yǎng)基缺乏細(xì)菌生長所需的碳源。當(dāng)外部碳源或缺時(shí), 藻際細(xì)菌的生長主要依靠藻類分泌的胞外有機(jī)質(zhì)為碳源[7]。藻、菌豐度相關(guān)性分析結(jié)果(表2)也驗(yàn)證了該結(jié)論, 即所有處理組和對照組中三角褐指藻的生長與藻際細(xì)菌的生長均顯著相關(guān), 其相關(guān)系數(shù)均大于0.6, 說明二者存在較強(qiáng)的正相關(guān)。

圖2 不同培養(yǎng)體系中三角褐指藻的藻際細(xì)菌生物量變化曲線

表2 不同培養(yǎng)體系中三角褐指藻和其藻際細(xì)菌生物量相關(guān)性分析結(jié)果

注: 表中**<0.01, 表示三角褐指藻和藻際細(xì)菌生物量顯著相關(guān)

不同處理組三角褐指藻生物量隨時(shí)間的變化如圖3所示。與對照組相比, 高、低濃度組的藻細(xì)胞密度顯著增加(<0.05), 其中高濃度組是對照組的18～ 20倍, 低濃度組是對照組的4～5倍; 并且初始添加的無機(jī)氮濃度越大, 三角褐指藻達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的藻生物量越高, 即初始添加40 μmol/L的培養(yǎng)體系LNA(1︰1)、LNA(4︰1)處理組中, 達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的最大密度均為1.48×106個(gè)/mL; 添加88.2 μmol/L的LN和LA處理組中藻細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的最大生物量分別為1.78×106個(gè)/mL和1.90×106個(gè)/mL; 添加500 μmol/L的HN、HA、HNA(1︰1)、HNA(4︰1)處理組中藻細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的最大生物量分別是6.14×106個(gè)/mL、6.29×106個(gè)/mL、6.99×106個(gè)/mL和6.84×106個(gè)/mL。說明在其他條件一致的情況下, 氮元素濃度是促進(jìn)三角褐指藻生長的主要因素。但是隨著時(shí)間的增加, 培養(yǎng)體系中無機(jī)氮濃度耗盡后, 藻細(xì)胞密度仍然維持在一個(gè)相對恒定的范圍, 這可能是藻細(xì)胞利用存儲(chǔ)在體內(nèi)的氮元素進(jìn)行生長繁殖[35]; 已有研究表明變形菌門的部分細(xì)菌可以分泌銨態(tài)氮, 為藻類的生長提供氮源[36], 當(dāng)細(xì)菌促進(jìn)藻類生長時(shí), 細(xì)菌生物量會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化[34]。并且, 本實(shí)驗(yàn)體系中藻菌生物量存在顯著正相關(guān)關(guān)系(表2), 因此, 體系中菌的存在也可能是促進(jìn)三角褐指藻生長的因素之一。圖1顯示屬和屬菌隨時(shí)間發(fā)生相對豐度變化, 有研究顯示屬細(xì)菌可以分解環(huán)境中的甲胺形成銨態(tài)氮[37], 而屬菌種則可以將環(huán)境中的硝態(tài)氮還原為銨態(tài)氮[38], 以供藻類利用。

圖3 不同培養(yǎng)體系中三角褐指藻生物量變化曲線

2.3 外部氮濃度和三角褐指藻生長的關(guān)系

在海洋環(huán)境中, 浮游植物的氮源主要包括人為污染和微生物代謝作用。人為污染主要包括人類過量施肥使氮元素通過河流進(jìn)入海洋, 其每年輸入量可達(dá)5.7 Tmol[3]; 而微生物代謝主要包括固氮過程、礦化作用、硝化作用及DNRA等過程。環(huán)境中不同形態(tài)的氮源進(jìn)入海洋微藻細(xì)胞內(nèi)先被還原為銨態(tài)氮, 而后被谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶同化生成氨基酸, 進(jìn)而合成蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)[39]。本文根據(jù)上述理論和質(zhì)量平衡定律, 研究了外部氮濃度和三角褐指藻體內(nèi)氮濃度的關(guān)系, 其變化趨勢如圖4所示。根據(jù)Fukuda等[40]測定的海洋細(xì)菌體內(nèi)氮含量為5.8 fg/個(gè)可知, 在本實(shí)驗(yàn)體系中, 細(xì)菌的最大生物量為1.4 μmol/L(以N計(jì)); 由圖4可知, 細(xì)菌的生物量(以N計(jì))遠(yuǎn)小于三角褐指藻, 其在計(jì)算所添加氮的質(zhì)量平衡結(jié)果中可忽略。因而, 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi), 溶液中無機(jī)氮的總消耗量和藻體內(nèi)氮的總增長量如表3所示。

從表3可知, LA、LNA(1︰1)、LNA(4︰1)、HA處理組中溶液無機(jī)氮的總消耗量和藻體內(nèi)氮的總增長量之間均不存在顯著差異(>0.05), 說明培養(yǎng)體系中消耗的無機(jī)氮大部分進(jìn)入三角褐指藻體內(nèi)。HN、HNA(1︰1)、HNA(4︰1)處理組中藻體內(nèi)氮的總增長量和溶液無機(jī)氮的總消耗量之間均存在顯著差異(<0.05), 且二者的比值均小于1, 說明實(shí)驗(yàn)初期添加的外部無機(jī)氮大部分被三角褐指藻和其藻際細(xì)菌吸收。LN處理組藻體內(nèi)氮的總增長量和溶液無機(jī)氮的總消耗量之間也存在顯著差異(<0.05), 且二者的比值大于1, 說明雖然促進(jìn)三角褐指藻生長的氮源主要來自實(shí)驗(yàn)初期外部無機(jī)氮的添加, 但是具有將環(huán)境中的硝態(tài)氮還原為銨態(tài)氮的細(xì)菌, 也可能為藻類生長提供氮源。

圖4 不同培養(yǎng)體系中外部氮濃度和藻體內(nèi)氮摩爾濃度變化

表3 不同培養(yǎng)體系中外部氮消耗量和Phaeodactylum tricornutum藻體內(nèi)氮增長量匯總

注: 表中無機(jī)氮消耗量和藻體內(nèi)氮增長量是以整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期計(jì)算, 具體計(jì)算方法詳見1.6。表中*<0.05, 表示無機(jī)氮消耗量和藻體內(nèi)氮增長量差異顯著。

通過比較高、低濃度組溶液中氮的變化趨勢, 即將圖4中的a、c、e、g分別與b、d、f、h進(jìn)行對比, 可以發(fā)現(xiàn)在無機(jī)氮濃度快速消耗的同時(shí)藻體內(nèi)氮濃度迅速增長, 并且藻生物量也迅速增加, 表明三角褐指藻主要依賴于培養(yǎng)體系中的無機(jī)氮源進(jìn)行生長繁殖。此外, 硝態(tài)氮作為唯一氮源時(shí)比銨態(tài)氮作為唯一氮源時(shí)其快速消耗所用時(shí)間更短; 當(dāng)兩種氮源同時(shí)存在時(shí), 硝態(tài)氮的消耗均出現(xiàn)了不同程度的延遲, 即與低濃度組相比, 高濃度組硝態(tài)氮由第2 d延遲至第6 d才開始消耗。有研究表明銨態(tài)氮由于同化作用所需能量少而更易被藻類優(yōu)先利用, 但是由于硝態(tài)氮具有較高的硅藻群落生物被膜滲透率及受相關(guān)還原酶活性的影響, 其更易利用硝態(tài)氮[41], 而銨態(tài)氮對硝態(tài)氮吸收的抑制易受氮、光的可利用率以及物種組成等環(huán)境條件影響[42]。

不同處理組的外部氮消耗率和三角褐指藻藻體內(nèi)氮增長率隨時(shí)間的變化如圖5所示。由圖5可知, 不同培養(yǎng)體系中外部氮消耗率和微藻體內(nèi)的氮增長率均在0～100%范圍內(nèi)變動(dòng)。但是, 低濃度組的混合氮源培養(yǎng)體系在第12 d其氮消耗率為負(fù)值, 培養(yǎng)體系中存在2.8～3.8 μmol/L的銨態(tài)氮, 而同時(shí)這兩個(gè)處理組中藻體內(nèi)氮的增長率也為負(fù)值。這可能是死亡的微藻細(xì)胞釋放微量的銨態(tài)氮, 進(jìn)而使藻體內(nèi)氮濃度降低造成的結(jié)果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明除了LN和LA處理組的外部氮消耗率和微藻體內(nèi)的氮增長率之間差異顯著之外(<0.05), 其余處理組二者之間的差異均不顯著(>0.05); 由于LN和LA處理組中外部氮消耗率在6 d之后均是0或100%, 有效數(shù)據(jù)較少, 可能造成其與藻體內(nèi)氮增長率間存在顯著差異?？傮w而言, 高、低濃度組的外部氮消耗率和藻體內(nèi)氮的增長率均近似相等, 即培養(yǎng)體系中消耗的無機(jī)氮基本全部進(jìn)入三角褐指藻體內(nèi), 進(jìn)一步說明促進(jìn)三角褐指藻生長的氮源主要來自實(shí)驗(yàn)初期外部無機(jī)氮的添加。

圖5 不同培養(yǎng)體系中外部氮消耗率和藻體內(nèi)氮增長率的變化

綜上所述, 三角褐指藻的藻際細(xì)菌可能對三角褐指藻的生長過程影響較小。研究證明細(xì)菌生物量不同, 其對藻類生長的影響也不同[34]。并且, 在本實(shí)驗(yàn)體系中, 細(xì)菌的生物量(最大生物量為1.40 μmol/L, 以N計(jì))小于三角褐指藻的生物量(最大生物量為532.7 μmol/L, 以N計(jì)), 其對氮的需求和轉(zhuǎn)化較小, 因而其對藻類生長、營養(yǎng)鹽利用影響較小。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在無機(jī)氮高濃度組屬細(xì)菌相對豐度比低濃度組有所減少,屬和屬細(xì)菌相對豐度在高濃度組均會(huì)隨時(shí)間降低。

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)體系的條件下, 因藻際細(xì)菌生物量較低, 整體對不同形態(tài)無機(jī)氮的轉(zhuǎn)化能力較弱, 其對三角褐指藻不同形態(tài)無機(jī)氮吸收利用影響較小, 促進(jìn)三角褐指藻生長的氮源主要來自外部無機(jī)氮的添加。

[1] CASCIOTTI K L. Nitrogen and oxygen isotopic studies of the marine nitrogen cycle[J]. Annual Review of Marine Science, 2016, 8: 379-407.

[2] STüEKEN E E, KIPP M A, KOEHLER M C, et al. The evolution of Earth’s biogeochemical nitrogen cycle[J]. Earth-Science Reviews, 2016, 160: 220-239.

[3] RAVEN J A, HANDLEY L L, ANDREWS M. Global aspects of C/N interactions determining plant-environ-ment interactions[J]. Journal of Experimental Botany, 2004, 55(394): 11-25.

[4] ROGATO A, AMATO A, IUDICONE D, et al. The diatom molecular toolkit to handle nitrogen uptake[J]. Marine Genomics, 2015, 24(1): 95-108.

[5] 蔡小龍, 羅劍飛, 林煒鐵, 等. 珠三角養(yǎng)殖水體中參與氮循環(huán)的微生物群落結(jié)構(gòu)[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2012, 52(5): 645-653.

CAI Xiaolong, LUO Jianfei, LIN Weitie, et al. Microbial community in nitrogen cycle of aquaculture water of the Pearl River Delta[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2012, 52(5): 645-653.

[6] SEYMOUR J R, AMIN S A, RAINA J B, et al. Zooming in on the phycosphere: the ecological interface for phytoplankton–bacteria relationships[J]. Nature Microbiology, 2017, 2: 17065.

[7] BEHRINGER G, OCHSENKüHN M A, CONG F, et al. Bacterial communities of diatoms display strong conservation across strains and time[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 659.

[8] 張艷敏, 王江濤, 譚麗菊. 海水中藻菌共培養(yǎng)體系對碳氮磷的吸收轉(zhuǎn)化[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2017, 37(14): 4843- 4851.

ZHANG Yanmin, WANG Jiangtao, TAN Liju. Uptake and transformation of carbon, nitrogen and phosphorus in the co-culture system of algae and bacteria in seawater[J]. Acta Ecologica Sinica, 2017, 37(14): 4843- 4851.

[9] VAN TOL H M, AMIN S A, ARMBRUST E V. Ubiquitous marine bacterium inhibits diatom cell division[J]. ISME Journal, 2017, 11(1): 31-42.

[10] COOPER M B, SMITH A G. Exploring mutualistic interactions between microalgae and bacteria in the omics age[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2015, 26: 147-153.

[11] AMIN S A, HMELO L R, VAN TOL H M, et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria[J]. Nature, 2015, 522: 98-101.

[12] MARKOU G, VANDAMME D, MUYLAERT K. Microalgal and cyanobacterial cultivation: The supply of nutrients[J]. Water Research, 2014, 65: 186-202.

[13] VU C H T, LEE H G, CHANG Y K, et al. Axenic cultures for microalgal biotechnology: Establishment, assessment, maintenance, and applications[J]. Biotechnology Advances, 2018, 36: 380-396.

[14] AMIN S A, GREEN D H, HART M C, et al. Photolysis of iron-siderophore chelates promotes bacterial-algal mutualism[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(40): 17071-17076.

[15] SHI F, WEI X X, FENG J F, et al. Variation of bacterial community associated within response to different inorganic nitrogen concentrations[J]. Acta Oceanologica Sinica, 2018, 37(12): 118- 128.

[16] GUILLARD R R L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates[M]. United States of America: Springer US, 1975: 29-60.

[17] GUILLARD R R, RYTHER J H. Studies of marine planktonic diatoms. I.andCleve[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1962, 8(2): 229-239.

[18] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 海洋監(jiān)測規(guī)范: 第7部分: GB 17378.7-2007[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社出版, 2007: 34.

General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China, National Standardization Administration of China. The specification for marine monitoring: Part 7: GB 17378.7- 2007[S]. Beijing: Published by China Standards Press, 2007: 34.

[19] 蔡卓平, 段舜山. 不同氮濃度下三角褐指藻生長特性和化學(xué)組成(英文)[J]. 生態(tài)環(huán)境, 2007, 16(6): 1633- 1636.

CAI Zuoping, DUAN Shunshan. Growth characteristics and chemical compositions ofunder different nitrogen concentrations[J]. Eco-logy and Environmental Sciences, 2007, 16(6): 1633-1636.

[20] 暨衛(wèi)東. 中國近海海洋環(huán)境質(zhì)量現(xiàn)狀與背景值研究[M]. 北京: 海洋出版社, 2011: 17-20, 223.

JI Weidong. Research on the current status and background value of China’s offshore marine environmental quality[M]. Beijing: Ocean Press, 2011: 17-20, 223.

[21] MARIE D, PARTENSKY F, JACQUET S, et al. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(1): 186-193.

[22] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 海洋調(diào)查規(guī)范: 第4部分: GB 12763.4-2007[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社出版, 2007: 111, 117.

General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China, National Standardization Administration of China. Specifications for oceanographic survey: Part 4: GB 12763.4-2007[S]. Beijing: Published by China Standards Press, 2007: 111, 117.

[23] 格拉斯霍夫. 海水分析方法[M]. 陸賢昆, 譯. 北京: 科學(xué)出版社, 1982: 166-169.

GRASSHOFF K. Seawater analysis methods[M]. LU Xiankun, Translation. Beijing: Science Press, 1982: 166-169.

[24] QIAO Y H, FENG J F, CUI S F, et al. Long-term changes in nutrients, chlorophyll a and their relationships in a semi-enclosed eutrophic ecosystem, Bohai Bay, China[J]. Marine Pollution Bulletin, 2017, 117(1/2): 222-228.

[25] WOOD S N. Generalized additive models: an introduction with R[M]. United States of America: CRC Press, 2010: 360-361.

[26] GROSSART H P, LEVOLD F, ALLGAIER M, et al. Marine diatom species harbour distinct bacterial com-munities[J]. Environmental Microbiology, 2005, 7(6): 860-873.

[27] PHILIPPIS R, MARGHERI M C, PELOSI E, et al. Exopolysaccharide production by a unicellular cyanobacterium isolated from a hypersaline habitat[J]. Journal of Applied Phycology, 1993, 5(4): 387-394.

[28] 張圣潔, 蔡中華, 朱偉勝, 等. 藻際環(huán)境中胞外聚合物的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2020, 60(8): 1521- 1533.

ZHANG Shengjie, CAI Zhonghua, ZHU Weisheng, et al. Advances in extracellular polymeric substances in phy-cosphere environment[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2020, 60(8): 1521-1533.

[29] DENG Y C, GUI Q, DUMONT M, et al.are the dominant active aerobic methanotrophs in a Chinese tidal marsh[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2019, 26: 636-646.

[30] ZHENG Q, LU J Y, WANG Y, et al. Genomic reconstructions and potential metabolic strategies of generalist and specialist heterotrophic bacteria associated with an estuaryculture[J]. FEMS microbiology Ecology, 2019, 95(3): fiz017.

[31] GUIDI F, PEZZOLESI L, VANUCCI S. Microbial dynamics during harmful dinoflagellategrowth: Bacterial succession and viral abundance pattern[J]. Microbiology Open, 2018, 7(4): e584.

[32] KUO R C, LIN S J. Ectobiotic and endobiotic bacteria associated withsp. Isolated from Long Island Sound[J]. Protist, 2013, 164(1): 60-74.

[33] PODDAR N, SEN R, MARTIN G J O. Glycerol and nitrate utilisation by marine microalgaeandsp and associated bacteria during mixotrophic and heterotrophic growth[J]. Algal Research, 2018, 33: 298-309.

[34] 段露露, 程蔚蘭, 張靖潔, 等. 共生菌促進(jìn)斜生柵藻生長和油脂合成[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2020, 31(2): 625-633.

DUAN Lulu, CHENG Weilan, ZHANG Jingjie, et al. Symbiotic bacteria facilitate algal growth and oil bio-synthesis in[J]. Chinese Jour-nal of Applied Ecology, 2020, 31(2): 625-633.

[35] OLOFSSON M, ROBERTSON E K, EDLER L, et al. Nitrate and ammonium fluxes to diatoms and dinoflagellates at a single cell level in mixed field communities in the sea[J]. Scientific Reports, 2019, 9: 1424.

[36] CIRRI E, POHNERT G. Algae-bacteria interactions that balance the planktonic microbiome[J]. New Phytologist, 2019, 223: 100-106.

[37] SULEIMAN M, ZECHER K, YUECEL O, et al. Interkingdom cross-feeding of ammonium from marine methylamine-degrading bacteria to the diatom[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2016, 82(24): 7113-7122.

[38] VAIDYA B, KUMAR R, KORPOLE S, et al.sp. nov., a halophilic and lipo-ly-tic bacterium isolated from coastal surface sea water[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2015, 65: 2056-2063.

[39] ALIPANAH L, ROHLOFF J, WINGE P, et al. Whole- cell response to nitrogen deprivation in the diatom[J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(20): 6281-6296.

[40] FUKUDA R, OGAWA H, NAGATA T, et al. Direct deter-mination of carbon and nitrogen contents of natural bacterial assemblages in marine environments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(9): 3352-3358.

[41] LV X N, WU Z X, SONG X X, et al. Nutritional strate-gy for the preferential uptake of NO3–-N by[J]. Hydrobiologia, 2019, 846: 109-122.

[42] DORTCH Q. The interaction between ammonium and nitrate uptake in phytoplankton[J]. Marine Ecology Progress Series, 1990, 61: 183-201.

Responses ofand its bacteria in the phycosphere to different inorganic nitrogen sources

WEI Xiao-xue1, SHI Feng3, CHEN Zi-xi4, FENG Jian-feng1, 2, ZHU Lin1

(1. College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300350, China; 2. Tianjin Key Laboratory of Environmental Treatment Technology for Complex Trans-Media Pollution, Tianjin 300350, China; 3. National Center for Science & Technology Evaluation, Beijing 100081, China; 4. College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)

Interactions between phytoplankton and bacteria represent a fundamental ecological relationship in a marine ecosystem. These interactions influence fundamental processes including nutrient provision, regeneration, primary production, and biogeochemical cycling at the ecosystem level. To further understand the relationship among nutrients, phytoplankton, and bacteria, the effects of bacteria in the phycosphere on the growth ofwere studied under different nutritional conditions in a laboratory by changing the type of nitrogen sources (nitrate and ammonium) and concentrations. Changes in the concentration of nitrogen in the solution as well as changes in the nitrogen content, biomass in, and bacterial abundance in the co-culture system includingand bacteria were measured. The differences in biomass changes ofand bacteria in the phycosphere under different culture systems were studied. The relationship between the nitrogen concentration in the solution and the growth ofwas investigated. Bacterial community structure at different growth stages ofwas analyzed using the second-generation high-throughput sequencing method (16S rDNA). The results of sequencing showed that the relative abundance ofand, which secrete ammonium to promote the growth of algae, increased with time in the high concentration groups (concentration of inorganic nitrogen: 500.0 μmol/L). Under different culture systems, the nitrogen source that promotes the growth ofmainly came from the addition of inorganic nitrogen at the beginning of the experiment. The nitrogen consumption rate in the solution and the increased nitrogen content rate inwere approximately equal under different culture systems. These results suggest that although bacteria in the phycosphere respond to different culture conditions, they might have little effect on the growth of.

ammonium; nitrate;; interactions between phytoplankton and bacteria

Mar. 29, 2021

P735

A

1000-3096(2022)01-0010-12

10.11759/hykx20210329001

2021-03-29;

2021-05-23

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFC1406403); 國家自然科學(xué)基金(31470536)

[The National Key R&D Program of China, No. 2018YFC1406403; National Natural Science Foundation of China, No. 31470536]

魏曉雪(1986—), 女, 山西永濟(jì)人, 博士研究生, 主要從事海洋藻類與微生物生態(tài)學(xué)研究, E-mail: weixiaoxue2006@126.com; 朱琳(1957—),通信作者, 博士, 教授, 主要從事生態(tài)毒理學(xué)和海洋生物學(xué)研究, E-mail: zhulin@nankai.edu.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)