靳彩玲，趙樹(shù)鵬，姬穎華，王犖楠，楊軍，張清琴，牛紅蕊

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

肺癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率高，每年約有180 萬(wàn)新發(fā)病例，約有160 萬(wàn)患者死于肺癌，占所有患癌癥死亡病例的19%［1］。根據(jù)組織學(xué)特征可將肺癌分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例的80%，在診斷時(shí)，近70%的非小細(xì)胞肺癌患者已處于晚期，5年存活率極低［2］。手術(shù)、化療和放療是肺癌的主要治療策略，盡管近年來(lái)治療方式有了很大的進(jìn)步，但大多數(shù)肺癌患者由于局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后仍不理想。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗癌藥。

銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）是提取自銀杏葉的銀杏二萜內(nèi)酯類化合物，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板活化因子拮抗劑，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗休克和清除自由基等藥理作用，臨床上多用于治療血栓形成、急性胰腺炎和心血管疾病等［3?4］。已有研究表明，銀杏內(nèi)酯B 可以對(duì)肺腺癌A549 細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞毒性作用［5］，但銀杏內(nèi)酯B 對(duì)肺癌的具體作用機(jī)制仍不清楚。本文旨在探究銀杏內(nèi)酯B 對(duì)肺癌細(xì)胞A549 惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物和主要試劑

銀杏內(nèi)酯B（批號(hào)：110863-201611，中國(guó)食品藥品檢定研究院，化學(xué)式：C20H24O10，分子量：424.40，純度≥95.6%）；人非小細(xì)胞肺癌株A549（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）；RRPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶和青-鏈霉素（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C0009M）、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C1062L）、BCA 試劑盒（批號(hào)：P0012）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號(hào)：A0208）（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；Transwell（批號(hào)：3450，美國(guó)Corning Costar 公司）；一抗Ki67（批號(hào)：ab15580）、PCNA（批號(hào)：ab18197）、Bax（批號(hào)：ab104156）、Bcl-2（批號(hào)：ab194583）、Caspase-3（批號(hào)：ab4051）、Cleaved Caspase-3（批號(hào)：ab2302）、MMP-9（批號(hào)：ab38898）、STAT3（批號(hào)：ab31370）、p-STAT3（批號(hào)：ab76315）和β-actin（批號(hào)：ab8227）（英國(guó)Abcam 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549 細(xì)胞于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱用高糖RMPI 1640 培養(yǎng)基（含10% FBS 和1%青-鏈霉素）培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，0.25%胰蛋白酶消化。

1.3 細(xì)胞處理及分組

將A549 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、銀杏內(nèi)酯B 低劑量組、銀杏內(nèi)酯B 中劑量組和銀杏內(nèi)酯B 高劑量組，共4 組，分別采用25、50、100 μmol/L 劑量的銀杏內(nèi)酯B 處理銀杏內(nèi)酯B 低、中、高劑量組的A549細(xì)胞。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞，接種于96 孔板（5 000 個(gè)/孔）培養(yǎng)24 h 后，按方法“1.3”項(xiàng)下分組處理后，每孔加入100 μL MTT溶液，孵育4 h后棄去MTT溶液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜室溫避光振蕩10 min，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀下測(cè)定各孔波長(zhǎng)為570 nm處的吸收值。

1.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲

Transwell上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的人工基底膜后，取轉(zhuǎn)染后的各組A549 細(xì)胞，上室中加入100 μL的細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL 的含F(xiàn)BS 的RMPI 1640 培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h 后用脫脂棉花擦掉基質(zhì)膠和上室細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色。于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況

將細(xì)胞接種于6 孔板，按“1.3”項(xiàng)下的方法分組處理A549細(xì)胞后，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%時(shí)用中槍頭垂直于6 孔板水平劃線，PBS 緩沖液清洗3 次后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取樣拍照。

劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h劃痕寬度

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

取轉(zhuǎn)染后的各組A549 細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)48 h 后，室溫下加入5 μL Annexin V FITC 混勻，最后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）10 μL 避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.8 Western Blot法檢測(cè)各項(xiàng)細(xì)胞因子水平

各組A549 細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白含量。10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流點(diǎn)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。加入一抗Ki67（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）和p-STAT3（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG（1∶10 000），膜上滴加電化學(xué)發(fā)光顯影液顯色。ImageJ V 軟件分析各組A549 細(xì)胞目的蛋白與β-actin比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組相比較，銀杏內(nèi)酯B中、高劑量組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明銀杏內(nèi)酯B 可以降低A549細(xì)胞活力。見(jiàn)表1。

表1 各組A549細(xì)胞活力的比較（±s）

表1 各組A549細(xì)胞活力的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

細(xì)胞活力（%）100.66±7.34 87.28±6.50 45.27±7.25*24.32±6.88*組別對(duì)照組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B中劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

2.2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)A549細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比較，銀杏內(nèi)酯B 中、高劑量組Ki67、PCNA 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明銀杏內(nèi)酯B能夠下調(diào)A549 細(xì)胞Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組A549細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表2 各組A549細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組別對(duì)照組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B中劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組PCNA 0.42±0.04 0.32±0.02 0.07±0.01*0.03±0.01*劑量（μmol/L）0 25 50 100 Ki67 0.26±0.04 0.18±0.03 0.06±0.02*0.01±0.01*

圖1 各組A549細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的比較

2.3 銀杏內(nèi)酯B對(duì)A549細(xì)胞侵襲情況的影響

與對(duì)照組相比較，銀杏內(nèi)酯B中、高劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明銀杏內(nèi)酯B能夠抑制細(xì)胞侵襲。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較（×200）

表3 各組A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

表3 各組A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

侵襲細(xì)胞數(shù)122.50±11.22 108.78±14.25 37.24±11.22*11.76±8.16*組別對(duì)照組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B中劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

2.4 銀杏內(nèi)酯B對(duì)A549細(xì)胞遷移情況的影響

與對(duì)照組相比較，銀杏內(nèi)酯B中、高劑量組劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明銀杏內(nèi)酯B 能夠抑制A549細(xì)胞遷移。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 各組A549細(xì)胞劃痕愈合情況比較（×200）

表4 各組A549細(xì)胞劃痕愈合率比較（±s）

表4 各組A549細(xì)胞劃痕愈合率比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

劃痕愈合率（%）84.78±3.98 72.25±3.03 46.35±2.11*22.57±2.24*組別對(duì)照組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B中劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

2.5 銀杏內(nèi)酯B對(duì)A549細(xì)胞凋亡情況的影響

與對(duì)照組相比較，銀杏內(nèi)酯B中、高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明銀杏內(nèi)酯B 能夠促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖4、表5。

表5 各組A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表5 各組A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

細(xì)胞凋亡率（%）5.78±1.98 12.36±3.64 22.23±6.94*38.77±5.11*組別對(duì)照組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B中劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組劑量（μmol/L）0 25 50 100

圖4 各組A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況比較

2.6 銀杏內(nèi)酯B 對(duì)A549 細(xì)胞Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase/Caspase-3比值的影響

與對(duì)照組相比較，銀杏內(nèi)酯B 中、高劑量組的Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase/Caspase-3 比值顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5、表6。

表6 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平變化比較（±s）

表6 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平變化比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組別對(duì)照組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B中劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組Cleaved Caspase/Caspase-3 0.48±0.04 0.60±0.08 1.12±0.10*1.68±0.15*劑量（μmol/L）0 25 50 100 Bax/Bcl-2 0.16±0.04 0.19±0.07 0.47±0.05*0.63±0.06*

圖5 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

2.7 銀杏內(nèi)酯B 對(duì)A549 細(xì)胞MMP-9 蛋白水平和p-STAT3/STAT3比值的影響

與對(duì)照組相比較，銀杏內(nèi)酯B 中劑量組和銀杏內(nèi)酯B 高劑量組MMP-9 蛋白表達(dá)水平、p-STAT3/STAT3 比值顯著降低（P＜0. 05）。見(jiàn)圖6、表7。

圖6 各組A549細(xì)胞MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較

表7 各組A549細(xì)胞MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平變化比較（±s）

表7 各組A549細(xì)胞MMP-9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平變化比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組別對(duì)照組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B中劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組p-STAT3/STAT3 1 0.83±0.06 0.51±0.09*0.43±0.08*劑量（μmol/L）0 25 50 100 MMP-9 1 0.96±0.04 0.67±0.05*0.44±0.05*

3 討論

由于西醫(yī)治療肺癌的預(yù)后較差，許多患者選擇通過(guò)替代療法來(lái)提高治療效果、減少不良反應(yīng)和改善生活質(zhì)量。運(yùn)用中藥及其提取物治療已經(jīng)成為肺癌的一種流行替代療法，尤其是在治療晚期非小細(xì)胞肺癌的老年患者中［6］。

癌細(xì)胞的過(guò)度增殖是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要因素之一。PCNA和Ki67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞增殖，PCNA為DNA聚合酶輔助蛋白，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)［7?8］。JIANG 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖增加耐藥卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。本文研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)銀杏內(nèi)酯B處理后，A549細(xì)胞的細(xì)胞活力和Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平降低。提示銀杏內(nèi)酯B可抑制A549細(xì)胞增殖。

腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力是直接決定惡性腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，肺癌細(xì)胞多呈侵襲性生長(zhǎng)，這是肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B 可通過(guò)上調(diào)miR-223-3p 表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本文研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B 具有減少A549 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和降低劃痕愈合率的作用。提示銀杏內(nèi)酯B能夠抑制A549細(xì)胞侵襲和遷移。

細(xì)胞凋亡屬于程序性細(xì)胞死亡，可通過(guò)消除舊的及受損的細(xì)胞維持生物機(jī)體內(nèi)生理平衡。Caspase-3屬于凋亡蛋白，抑制Caspase-3 蛋白活性可阻斷凋亡途徑，起到抑制凋亡的作用［10］。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因Bax 升高能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bcl?2 則能抑制細(xì)胞凋亡，Bax/Bcl-2 的比值能反應(yīng)細(xì)胞凋亡狀況［11］。楊彬等［12］研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B 可能通過(guò)抑制Mfn1 的表達(dá)，調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bax 活性，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。CHAN 等［13］研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B 可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)銀杏內(nèi)酯B 處理后，A549 細(xì)胞細(xì)胞凋亡率和Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase/Caspase-3比值升高。提示銀杏內(nèi)酯B能夠促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）與腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，相關(guān)研究表明MMP-9過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)各種癌細(xì)胞包括肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，MMP-9 表達(dá)與肺癌惡性程度呈正相關(guān)［14］。STAT3 是一種致癌轉(zhuǎn)錄因子，其過(guò)度激活可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞凋亡［15?16］。LI 等［17］研究發(fā)現(xiàn)中藥扶正抗癌方可通過(guò)STAT3/MMP-9 途徑抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本文研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B 具有降低A549 細(xì)胞MMP-9 蛋白水平和p-STAT3/STAT3 比值的作用。提示銀杏內(nèi)酯B可能通過(guò)MMP9/STAT3 通路調(diào)控肺癌細(xì)胞A549 惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B 能夠抑制A549 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡過(guò)程。本文為臨床應(yīng)用銀杏內(nèi)酯B治療肺癌提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。