張素華 徐月新

江蘇省蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 揚(yáng)州 225001

正常成人骨骼由皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨組成，其比例在不同部位有所差異，如椎骨以松質(zhì)骨為主，長(zhǎng)骨以皮質(zhì)骨為主。骨重塑是新骨替代舊骨的過程，大約每十年骨骼會(huì)更新一次，主要是在舊骨的基礎(chǔ)上，骨重塑單元招募破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收，隨后成骨細(xì)胞進(jìn)行骨形成和礦化，最終在新骨吸收腔內(nèi)形成新骨。骨質(zhì)疏松癥一般是由于衰老引起骨重塑的速率改變，導(dǎo)致骨量丟失、骨微環(huán)境結(jié)構(gòu)破壞等[1]。據(jù)估計(jì)，約30%年齡超過50歲的女性會(huì)經(jīng)歷一次骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折，這是由于荷爾蒙水平變化及身體運(yùn)動(dòng)減少、破壞了骨重塑所引起的[2]。骨質(zhì)疏松癥的早期診斷比較困難，因此臨床上迫切希望能夠早日探索出一種靈敏度高、特異性好、方便性佳的新型生物標(biāo)志物進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥的早期篩查和診斷。

1 circRNA的概述

早在20世紀(jì)70年代，借助電子顯微鏡就已經(jīng)觀察到了真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中存在部分circRNAs，但當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是異常剪接產(chǎn)生的“垃圾”[3]。后來研究[4]發(fā)現(xiàn)circRNAs是由前體mRNA通過反向剪接產(chǎn)生的單鏈共價(jià)閉合RNA分子。近年來隨著高通量測(cè)序、多組學(xué)研究及生物信息學(xué)分析等飛速發(fā)展，已經(jīng)鑒定出數(shù)千萬種circRNAs，它們一般由一個(gè)或兩個(gè)外顯子反向剪接產(chǎn)生，這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)不易被外切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定。而且在外泌體、唾液及血清中都發(fā)現(xiàn)有circRNAs的表達(dá)，提示circRNAs可能是潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[5]。

1.1 circRNA的特征

目前高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)數(shù)萬種circRNAs在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，其中人體組織大約有3萬個(gè)不同的circRNAs[6]。人體內(nèi)circRNAs長(zhǎng)度通常為幾百個(gè)核苷酸左右，它們是一類由非標(biāo)準(zhǔn)剪接(即反向剪接)產(chǎn)生的非編碼RNA，在這過程中下游的剪接供體位點(diǎn)與上游的剪接受體位點(diǎn)共價(jià)連接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。circRNAs這類轉(zhuǎn)錄本大多由2～3個(gè)外顯子組成，也有只含內(nèi)含子的circRNAs和同時(shí)包含內(nèi)含子及外顯子的circRNAs[7]。除了內(nèi)含子circRNAs外，大部分circRNAs通常定位在細(xì)胞質(zhì)。一般circRNAs的表達(dá)水平只有其相對(duì)應(yīng)的線性轉(zhuǎn)錄水平的5%～10%，這是因?yàn)槠浞聪蚣艚拥男瘦^低，但是由于它們?nèi)狈ψ杂赡┒?，不易被核酸外切?RNase R)降解，使部分circRNAs表達(dá)可以富集到較高水平[8]。circRNAs表達(dá)是一種古老的基因組特性，在數(shù)億年進(jìn)化中保持不變，它們可以在非常簡(jiǎn)單的生物體基因組表達(dá)，如釀酒酵母、阿米巴變形蟲等，也可以在植物中表達(dá)，這些都是源于它們具有廣泛的選擇性剪接程序[9]。

1.2 circRNA的形成機(jī)制

circRNA依賴剪接體去除內(nèi)含子并將外顯子連接在一起，形成成熟的mRNA并催化線性mRNA前體剪接。circRNA通常需要一個(gè)外顯子供體的剪接位點(diǎn)，但不與下游另一個(gè)外顯子的受體剪接位點(diǎn)連接，而是與上游受體的剪接位點(diǎn)連接，這一過程稱為反向剪接。剪接體選擇哪些外顯子進(jìn)行環(huán)化的機(jī)制尚不完全清楚，但這個(gè)過程顯然需要將反向剪接外顯子側(cè)面的兩個(gè)內(nèi)含子靠近。目前已知有3種機(jī)制可以實(shí)現(xiàn)這一步：①內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化：主要成分是順式作用元件(短非編碼調(diào)控序列)，位于側(cè)翼內(nèi)含子內(nèi)，使得側(cè)翼內(nèi)含子反向互補(bǔ)序列配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[10];②RNA結(jié)合蛋白(RBP)驅(qū)動(dòng)環(huán)化:反式作用因子(結(jié)合順式作用元件)識(shí)別并位于環(huán)狀外顯子側(cè)面的內(nèi)含子上，通過蛋白-蛋白相互作用或RBPs二聚化作用，使得剪接位點(diǎn)靠近，剪接小體參與反向剪接[11];③套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化：這一過程源于線性剪接，轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA部分折疊與非臨近外顯子靠近，導(dǎo)致外顯子跳躍，形成套索中間體進(jìn)一步剪接產(chǎn)生[12]。

1.3 circRNAs 的生物學(xué)功能

2017年Science的一篇報(bào)道[13]為circRNAs 的生物學(xué)功能研究提供了重要的證據(jù)。研究[13]發(fā)現(xiàn)小鼠缺失circRNA(Cdr1as)會(huì)導(dǎo)致miRNA(miR-7)表達(dá)異常并影響腦內(nèi)突觸傳遞。雖然circRNAs表達(dá)量較少，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)谏砑安±項(xiàng)l件下發(fā)揮著潛在的作用。它們通過不同的機(jī)制參與了基因表達(dá)調(diào)控：①circRNAs充當(dāng)miRNA海綿：一些circRNAs可以與miRNA結(jié)合，以阻止miRNA與mRNA靶標(biāo)的相互作用(即它們充當(dāng)miRNA海綿)。比如Cdr1as廣泛存在于哺乳動(dòng)物大腦中并高度保守，且含有大量miR-7結(jié)合位點(diǎn)。在小鼠中敲除Cdr1as，會(huì)導(dǎo)致大腦中miR-7靶基因Fos表達(dá)顯著升高[13]；②circRNAs可以結(jié)合RNA結(jié)合蛋白(RBPs)并介導(dǎo)RBPs的活性或定位。比如HuR可能與HeLa細(xì)胞中一半的circRNAs結(jié)合，HuR與circPABPN1的結(jié)合阻止了其與線性PABPN1 mRNA的結(jié)合，從而導(dǎo)致PABPN1轉(zhuǎn)錄翻譯下降，細(xì)胞增殖減少[14]；③作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因：盡管大部分circRNAs定位在細(xì)胞質(zhì)中，但發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中的一些circRNAs參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控。比如EIciRNAs可以與U1snRNPs (U1 small nuclear ribonucleoproteins)相互作用形成復(fù)合物，并在其親本基因啟動(dòng)子上與Pol II相互作用，增強(qiáng)基因表達(dá)[15]；④競(jìng)爭(zhēng)其線性mRNA的剪接：circRNAs的生成會(huì)影響其宿主基因的表達(dá)，在果蠅中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，去除剪接體成分會(huì)導(dǎo)致circRNAs水平升高，而其線性mRNA水平降低。這是由于線性剪接和反向剪接通常使用相同的標(biāo)準(zhǔn)剪接受體和供體，所以circRNAs的產(chǎn)生會(huì)影響線性mRNA的生成[16]；⑤作為蛋白質(zhì)合成的模板：它們主要位于細(xì)胞質(zhì)且大多來源外顯子，除了其非編碼的功能，研究[17]發(fā)現(xiàn)circRNAs可能與核糖體翻譯相關(guān)，并以依賴內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)進(jìn)行翻譯；⑥circRNAs是很有前途的生物標(biāo)志物：環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外(血漿、唾液等)中穩(wěn)定存在[18]。提示疾病相關(guān)的circRNAs是具有潛力的生物標(biāo)志物。

2 circRNAs與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生相關(guān)

近年來circRNA是研究的熱點(diǎn)，但是其在骨質(zhì)疏松癥中研究相對(duì)較少。circRNA通過直接參與骨相關(guān)的信號(hào)通路，形成circRNA-miRNA-mRNA軸，參與骨重塑過程。

2.1 circRNA與成骨細(xì)胞

成骨細(xì)胞是介導(dǎo)骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的形成、分泌及礦化，并進(jìn)一步直接影響骨骼重塑。一般間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化形成成骨細(xì)胞，但這一過程需要一系列細(xì)胞外信號(hào)及轉(zhuǎn)錄因子的精細(xì)調(diào)控。Huang等[19]通過重組NELL-1誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞成骨分化，并進(jìn)行RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)關(guān)鍵的circRNAs：circRFWD2和circINO80，敲除這兩個(gè)circRNAs會(huì)影響其成骨分化進(jìn)程。作為miRNA海綿作用，這兩個(gè)circRNAs與hsa-miR-6817-5p相互作用，并調(diào)控其表達(dá)。Zheng等[20]誘導(dǎo)牙周韌帶干細(xì)胞成骨分化，相較于第0天細(xì)胞，第3天細(xì)胞中有118個(gè)circRNAs差異表達(dá)，第7天細(xì)胞中有128個(gè)circRNAs差異表達(dá)，第14天細(xì)胞中有139個(gè)circRNAs差異表達(dá)。Peng等[21]在誘導(dǎo)上頜竇膜干細(xì)胞成骨分化中，發(fā)現(xiàn)circRNA_33287表達(dá)上調(diào)，并充當(dāng)miR-214-3p海綿，發(fā)揮促進(jìn)成骨分化的作用。Long等[22]篩選了小鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化中差異表達(dá)的circRNAs，其中40種circRNAs表達(dá)上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-338-3p與mmu_circRNA_013422及mmu_circRNA_22566的表達(dá)上調(diào)相關(guān)聯(lián)。Qian等[23]通過BMP2誘導(dǎo)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1并得到1 581種差異表達(dá)的circRNAs，而且鑒定出circ19142和circ5846與該進(jìn)程相關(guān)聯(lián)。大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cdr1as可以作為miR-7海綿參與多種生物進(jìn)程，Li等[24]運(yùn)用牙周韌帶干細(xì)胞成骨分化并發(fā)現(xiàn)Cdr1as表達(dá)升高，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cdr1as通過抑制miR-7b表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控GDF5表達(dá)及Smad1/5/8磷酸化等，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明敲低Cdr1as會(huì)導(dǎo)致骨形成減少。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)在人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中，存在1 505個(gè)circRNAs表達(dá)下調(diào)，而抑制circIGSF11的表達(dá)會(huì)相應(yīng)的增加miR-199b-5p的表達(dá)，提示circRNA-miRNA相互作用影響了細(xì)胞成骨分化。Li等[26]對(duì)雌激素受體敲低的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序，篩選出差異表達(dá)circRNAs共146種，并通過預(yù)測(cè)提示雌激素受體可能通過circRNA 2∶27713879∣27755789和circRNA 2∶240822115∣240867796-miR-328-5p-mRNA軸調(diào)控成骨分化。Du等[27]篩選出大鼠牙濾泡細(xì)胞成骨分化中差異表達(dá)的circRNAs共266種，其中circFgfr2通過miR-133/BMP6促進(jìn)成骨分化。

2.2 circRNA與破骨細(xì)胞

破骨細(xì)胞是介導(dǎo)骨吸收的重要細(xì)胞，其增殖、分化及活性直接影響骨量改變。過度骨吸收會(huì)導(dǎo)致骨平衡被打破，進(jìn)一步引起骨質(zhì)疏松。Dou等[28]發(fā)現(xiàn)了RAW264.7破骨細(xì)胞生成的4個(gè)不同階段差異表達(dá)的circRNAs共24種。Chen等[29]利用Rankl和CSF1誘導(dǎo)骨髓單核/巨噬細(xì)胞破骨生成，其中circRNA_28313表達(dá)明顯升高，而在卵巢摘除小鼠中尾靜脈注射Lsh-circRNA_28313會(huì)引起小鼠骨吸收減弱，骨量增加。

3 circRNA與骨質(zhì)疏松癥

由于骨質(zhì)疏松癥往往沒有明顯的臨床表現(xiàn)，一般發(fā)生骨折后才進(jìn)一步確診。近些年不少研究通過研究骨質(zhì)疏松性骨折案例，試圖找尋新的早期診斷及治療靶點(diǎn)。Ouyang等[30]針對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折患者中約5%的骨不連患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在差異表達(dá)的circRNAs，并證明了hsa_circ_0074834通過miR-942-5p調(diào)控了ZEB1和VEGF，進(jìn)而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。通過裸鼠異位成骨及股骨單皮質(zhì)缺損模型發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0074834可以修復(fù)骨缺損。對(duì)20例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女血清circRNAs進(jìn)行的分析[31]，發(fā)現(xiàn)387種circRNAs顯著差異表達(dá)，其中circRNA_0016624表達(dá)下降，發(fā)現(xiàn)它是作為miR-98海綿，進(jìn)一步調(diào)控了BMP2的表達(dá)。而另一項(xiàng)針對(duì)40例骨質(zhì)疏松癥病人血清進(jìn)行的CircRNA芯片的研究[32]發(fā)現(xiàn)，其中circ_0006873和circ_0002060表達(dá)明顯上調(diào)，并通過皮爾森關(guān)聯(lián)分析了這兩種CircRNA與骨質(zhì)疏松臨床特征的關(guān)系，從而確定circ_0002060是骨質(zhì)疏松癥診斷的分子標(biāo)志物。一項(xiàng)對(duì)于28例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女外周血單核細(xì)胞(PBMCs)進(jìn)行的CircRNA芯片研究[33]，運(yùn)用熒光定量PCR及關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)hsa_Circ_0001275是潛在的診斷分子標(biāo)志物。針對(duì)3例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女外周血淋巴細(xì)胞(PBL)進(jìn)行RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)260種circRNAs差異表達(dá)[34]。見表1。

表1 骨質(zhì)疏松癥中CircRNA表達(dá)譜Table 1 CircRNA expression profiles in osteoporosis

4 討論

circRNAs是分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、功能復(fù)雜的RNA分子。雖然circRNA在癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及心臟疾病中取得較大的進(jìn)展，但在骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等骨科疾病中的研究較少。目前大部分研究只是局限于circRNA芯片等表達(dá)譜的分析，缺乏circRNA調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制研究。少數(shù)機(jī)制研究也是主要關(guān)注circRNA作為miRNA海綿調(diào)控這一生物進(jìn)程。但是circRNA的功能多種多樣，例如翻譯的功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能都值得在骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域進(jìn)行深入研究。

血液來源的生物標(biāo)志物因其無創(chuàng)性，在癌癥早期診斷、產(chǎn)前診斷方面都發(fā)揮著重要作用。目前已經(jīng)報(bào)道circRNA在骨質(zhì)疏松癥病人血液中差異表達(dá)，當(dāng)然這里涉及了血清、血漿、外周血單核細(xì)胞及外周血淋巴細(xì)胞等，多方面闡釋了circRNA做為骨質(zhì)疏松癥生物標(biāo)志物的巨大潛力。當(dāng)然這只是剛開始，雖然有研究已經(jīng)利用異位成骨及骨缺損模型研究circRNA在骨質(zhì)疏松癥中的作用，但是完善circRNA在動(dòng)物方面的研究大勢(shì)所趨，包括骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。從臨床出發(fā)最終還是要回歸臨床，擴(kuò)大骨質(zhì)疏松癥樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

總而言之，這些研究雖然證實(shí)了circRNA在骨發(fā)育方面的作用及其作為骨質(zhì)疏松癥生物標(biāo)志物的價(jià)值，但在臨床常規(guī)開展及個(gè)體化治療方面，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，希望獲得能直接反映骨骼形成及骨結(jié)構(gòu)的變化。未來一方面應(yīng)進(jìn)一步深入對(duì)于circRNA在骨質(zhì)疏松癥中的機(jī)制研究，另一方面應(yīng)繼續(xù)探討將其作為臨床篩查及診斷標(biāo)志物的可能性。