王皓 凃峰 趙文斌 張麟

武漢市第一醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430022

脛骨骨折為臨床常見(jiàn)骨折類(lèi)型之一，伴隨疼痛、日?；顒?dòng)受限等，不僅影響患者生活質(zhì)量，還給家庭和社會(huì)造成一定負(fù)擔(dān)[1]。近年創(chuàng)傷性骨折和骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率逐年上升[2]，而骨折愈合病理過(guò)程較為復(fù)雜，涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化性和積累、成骨細(xì)胞的分化、成熟以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成和血管生成等[3]。其中，成骨細(xì)胞分化和成熟是骨形成的基礎(chǔ)，在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)/SMAD/Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)信號(hào)通路的激活為成骨細(xì)胞分化和成熟所必需，在促進(jìn)骨形成和骨愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]，因此BMP-2/SMAD/Runx2通路可能是骨折治療的潛在靶標(biāo)。骨化三醇膠囊(Cal)的活性成分為維生素D3羥化代謝物，可通過(guò)與維生素D受體結(jié)合促進(jìn)消化道等對(duì)鈣的吸收，刺激成骨分化、提高骨組織密度、促進(jìn)新骨形成，臨床已用于骨質(zhì)疏松等疾病的治療[5-6]。陳曉婷等[7]研究顯示，Cal可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在BMP誘導(dǎo)下的成骨分化作用。本研究通過(guò)構(gòu)建脛骨骨折大鼠模型，研究Cal對(duì)骨折愈合的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡SPF級(jí)SD大鼠，體重320～340 g，購(gòu)買(mǎi)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002]。該研究經(jīng)武漢市第一醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：No.0016014)，所有實(shí)驗(yàn)在3R原則下進(jìn)行。

1.2 試劑及儀器

1.2.1試劑：骨化三醇膠囊(規(guī)格：0.5 μg)購(gòu)自正大制藥有限公司；BMP特異抑制劑Noggin(規(guī)格：10 μg，純度>97%)購(gòu)自Abbexa公司；大鼠堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型前膠原N-端肽(PINP)及骨鈣素(OCN)ELISA試劑盒購(gòu)自生工生物公司；小鼠抗BMP-2、Runx2購(gòu)自Santa cruz公司；馬抗小鼠、羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG及β-actin抗體購(gòu)自CST公司；兔抗SMAD1/5/8購(gòu)自O(shè)riGene公司；兔抗p-SMAD1/5/8購(gòu)自MilliporeSigma公司，等。

1.2.2儀器：蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、電泳儀購(gòu)自BioRad公司；小動(dòng)物顯微斷層掃描儀購(gòu)自Scanco Medical公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自Roche公司,等。

1.3 方法

1.3.1脛骨骨折模型制備及分組：根據(jù)文獻(xiàn)制備脛骨骨折模型[8-9]：腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)將大鼠麻醉、固定在手術(shù)臺(tái)上，在左下肢脛骨外側(cè)作一縱向切口(約1.5 cm)，逐層剝離皮膚、脛前肌，暴露脛骨中段，打孔后將克氏針完全插入脛骨骨髓腔中，進(jìn)行髓內(nèi)針閉合固定；于脛骨結(jié)節(jié)下約0.5 cm處以骨剪橫向截?cái)嗝劰?，形成骨折，沖洗后逐層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d，每日給予青霉素腹腔注射以預(yù)防感染。術(shù)后立即對(duì)大鼠進(jìn)行X光檢查，造模成功大鼠可見(jiàn)明顯骨折線(xiàn)。將39只脛骨骨折大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為脛骨骨折組、Cal組、Cal+Noggin組，每組13只，依次給予灌胃生理鹽水、灌胃10 ng/mL Cal溶液[10]、灌胃10 ng/mL Cal溶液+骨折處經(jīng)皮注射50 ng/mL Noggin溶液[11]，灌胃體積10 mL/(kg·d)，注射體積2 mL/(kg·d)，另取13只正常大鼠不進(jìn)行手術(shù)，僅灌胃和注射等量生理鹽水，作為對(duì)照組(Cont)組，共給藥4周。

1.3.2血清成骨相關(guān)因子檢測(cè)：末次給藥24 h后，腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉(100 mg/kg)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血(每組取10只)，分離血清保存在-80 ℃。按說(shuō)明書(shū)將血清與相應(yīng)試劑盒試劑混勻后，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALP、OCN、PINP水平。分離留取各組大鼠左側(cè)脛骨，剔除附著的肌肉等軟組織，自近心端取出脛骨內(nèi)的克氏針，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3X射線(xiàn)檢測(cè)：將1.3.2中脛骨樣本放在X射線(xiàn)照射平臺(tái)上進(jìn)行拍照，參數(shù)設(shè)置為：40 kV電壓、10 mA電流、標(biāo)本距X射線(xiàn)管45 cm、曝光0.06 ms。

1.3.4微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro CT)檢測(cè)：將1.3.2中脛骨樣本放在專(zhuān)用圓筒中固定，參數(shù)設(shè)置為：70 kVp X射線(xiàn)、每180°采集1 000個(gè)圖像。利用機(jī)器自帶的CT評(píng)價(jià)程序?qū)钦蹟喽诵律丘杞M織進(jìn)行分析，獲得三維圖像和骨痂形態(tài)學(xué)參數(shù)：骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁分離度(TB.SP)、骨小梁數(shù)量(TB.N)、骨小梁厚度(TB.TH)及從結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)，以評(píng)價(jià)新生骨質(zhì)的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。

1.3.5HE染色：將1.3.2中脛骨樣本固定后(每組取3只)，在0.5 mol/L EDTA溶液中放置4周脫鈣。脫鈣、常規(guī)脫水等處理后包埋在石蠟中，從骨折斷端處開(kāi)始冠狀切片(5 μm/片)，經(jīng)蘇木素染液孵育10 min、鹽酸-乙醇分化20 s、PBS脫色40 s、伊紅染液孵育1 min后封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察斷端處組織形態(tài)。

1.3.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：取出1.3.2中斷端骨痂組織和Cont組骨膜組織(每組取10只)加入蛋白裂解液提取骨組織中蛋白質(zhì)并采用BCA法測(cè)定濃度。取25 μg加入5×SDS緩沖液煮沸，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜、5%牛奶封閉、一抗(包括BMP-2、SMAD1/5/8、Runx2、p-SMAD1/5/8、β-actin)4 ℃孵育過(guò)夜、二抗室溫孵育40 min后，將PVDF膜放入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液中顯影后拍照。根據(jù)蛋白條帶的灰度值分析其相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Cal對(duì)脛骨骨折大鼠骨愈合的影響

Cont組無(wú)骨折線(xiàn)。脛骨骨折組、Cal+Noggin組骨折線(xiàn)較為明顯，出現(xiàn)少量新生骨痂；Cal組骨折線(xiàn)幾乎不可見(jiàn)，有大量新生骨痂。見(jiàn)圖1。

圖1 脛骨X射線(xiàn)圖Fig.1 X-ray image of the tibia注：箭頭所指為骨折處。

2.2 Cal對(duì)脛骨骨折大鼠新生骨痂微結(jié)構(gòu)的影響

相較于Cont組，脛骨骨折組骨密度、骨小梁數(shù)量及厚度、骨體積分?jǐn)?shù)、SMI均增高，骨小梁分離度降低(P<0.05)；相較于脛骨骨折組，Cal組骨密度、骨小梁數(shù)量及厚度、骨體積分?jǐn)?shù)、SMI均增加，骨小梁分離度降低(P<0.05)；相較于Cal組，Cal+Noggin組骨密度、骨小梁數(shù)量及厚度、骨體積分?jǐn)?shù)、SMI均降低，骨小梁分離度增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

圖2 脛骨micro CT掃描圖Fig.2 Micro-CT scan of the tibia

表1 4組大鼠骨密度和骨微結(jié)構(gòu)比較Table 1 Comparison of bone density and bone microstructure among the 4

2.3 Cal對(duì)脛骨骨折大鼠斷端組織形態(tài)的影響

Cont組不可見(jiàn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。脛骨骨折組、Cal+Noggin組骨折斷端周?chē)梢?jiàn)非肥大的軟骨細(xì)胞，斷端間隙中有少量成骨細(xì)胞。Cal組骨折斷端周?chē)梢?jiàn)致密肥大的軟骨細(xì)胞、新形成的骨小梁，間隙中有大量成骨細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

圖3 脛骨斷端組織HE染色圖(100×)Fig.3 HE staining image of stump tissue of the tibia (100×)注：黑色箭頭為軟骨細(xì)胞，白色箭頭為成骨細(xì)胞

2.4 Cal對(duì)脛骨骨折大鼠成骨因子水平的影響

相較于Cont組，脛骨骨折組ALP、OCN、PINP水平增加(P<0.05)；相較于脛骨骨折組，Cal組ALP、OCN、PINP水平增加(P<0.05)；相較于Cal組，Cal+Noggin組ALP、OCN、PINP水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠成骨因子水平比較Table 2 Comparison of the levels of osteogenic factors among the 4

2.5 Cal對(duì)脛骨骨折大鼠骨痂中BMP-2、SMADs及Runx2蛋白表達(dá)的影響

相較于Cont組，脛骨骨折組BMP-2、Runx2及p-SMAD1/5/8/SMAD1/5/8表達(dá)增高(P<0.05)；相較于脛骨骨折組，Cal組上述BMP-2等表達(dá)增高(P<0.05)；相較于Cal組，Cal+Noggin組上述BMP-2等表達(dá)減低(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表3。

表3 4組大鼠BMP-2、SMAD1/5/8、p-SMAD1/5/8、Runx2蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of BMP-2, SMAD1/5/8, p-SMAD1/5/8, and Runx2 protein expression among the 4

圖4 BMP-2、SMAD1/5/8、p-SMAD1/5/8、Runx2蛋白印記圖Fig.4 The imprinting maps of BMP-2, SMAD1/5/8, p-SMAD1/5/8, and Runx2 protein注：A：Cont組，B：脛骨骨折組，C：Cal組，D：Cal+Noggin組

3 討論

骨折發(fā)生后，破骨細(xì)胞遷移到損傷處將受損和死亡骨細(xì)胞吸收，為新骨形成提供前提；然后成骨細(xì)胞遷移到損傷處，分泌新骨基質(zhì)，形成新骨并促進(jìn)骨結(jié)合和骨連接[12]。抑制破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化，可造成骨愈合延遲或骨不愈，本研究主要從成骨分化和成熟的角度，分析Cal在骨折愈合中對(duì)骨形成的調(diào)節(jié)作用。

骨折大鼠在無(wú)藥物干預(yù)時(shí)，第6周后骨密度逐漸增加，骨小梁逐漸增多，骨形成及吸收代謝活動(dòng)活躍，Runx2、BMP等達(dá)到峰值[13]。為觀(guān)察到藥物作用，本研究在第4周取樣，此時(shí)骨折組大鼠骨折線(xiàn)明顯，出現(xiàn)少量新生骨痂，骨折斷端新生骨痂的骨小梁分離度較低，骨小梁增多增厚，骨體積分?jǐn)?shù)、骨密度及SMI增高，表明骨折第4周骨組織出現(xiàn)自我愈合，但骨痂形成較少，骨微結(jié)構(gòu)不完整。骨形成是骨折愈合的前提，血清中的ALP、PINP、OCN等可衡量機(jī)體骨形成。本研究中，骨折模型組大鼠ALP、OCN、PINP水平高于Cont組，表明骨折后骨形成增加，這由于機(jī)體骨組織具有一定自我愈合能力。李頌兵等[14]報(bào)道，Cal可提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性骨密度，減輕腰背疼痛感。廖騰等[15]發(fā)現(xiàn)，Cal可明顯提高抗旋髓內(nèi)釘固定的股骨骨折患者的骨密度，促進(jìn)骨形成。本研究結(jié)果顯示，給予Cal治療的大鼠骨折線(xiàn)幾乎不可見(jiàn)，斷端周?chē)梢?jiàn)致密肥大的軟骨細(xì)胞，新生骨痂及骨小梁增多，骨小梁厚度、骨體積分?jǐn)?shù)及密度、血清PINP、ALP、OCN水平及SMI均高于骨折模型組，骨小梁分離度低于骨折模型組，表明Cal可促進(jìn)骨折大鼠新生骨痂中骨量增加、骨微結(jié)構(gòu)成熟及骨折愈合。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的BMP-2具有較強(qiáng)的促成骨分化作用，一方面，BMP-2被細(xì)胞膜上受體識(shí)別，激活絲氨酸/蘇氨酸激酶等，促進(jìn)SMAD1/5/8被磷酸化為p-SMAD1/5/8，與SMAD4形成復(fù)合物后移至細(xì)胞核，啟動(dòng)經(jīng)典的BMP-2/SMAD成骨信號(hào)[4]。另外，BMP-2還可啟動(dòng)Runx2等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)關(guān)鍵成骨細(xì)胞特異性基因(包括ALP、OCN等)轉(zhuǎn)錄翻譯[16]。研究顯示，沉默BMP-2的拮抗劑Gremlin2，可通過(guò)促進(jìn)BMP-2/Smad/Runx2通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[17]。多種藥物可通過(guò)激活BMP-2/SMAD/Runx2通路促進(jìn)骨折愈合[18-19]。本研究結(jié)果顯示，骨折模型組大鼠新生骨痂中BMP-2、Runx2及p-SMAD1/5/8/SMAD1/5/8表達(dá)較Cont組增高，表明骨折后骨組織中BMP-2/SMAD/Runx2通路被活化，可能與成骨細(xì)胞活化有關(guān)。Cal作為維生素D補(bǔ)充劑，可促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣磷的吸收，調(diào)節(jié)鈣磷穩(wěn)態(tài)[20]。近年研究指出，含Cal的微孔多糖復(fù)合支架可促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠的成骨作用，促進(jìn)骨再生[21]。本研究觀(guān)察到Cal治療后新生骨痂中BMP-2、Runx2及p-SMAD1/5/8/SMAD1 /5/8表達(dá)較骨折組進(jìn)一步增高，表明Cal可促進(jìn)骨組織BMP-2/SMAD/Runx2通路活化。本研究還發(fā)現(xiàn)，Cal對(duì)骨折大鼠骨密度及新生骨痂微結(jié)構(gòu)的改善作用，可被BMP-2特異性抑制Noggin逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步表明Cal可能通過(guò)激活BMP-2/SMAD/Runx2通路，誘導(dǎo)成骨分化，促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，Cal可能通過(guò)激活BMP-2/SMAD/Runx2通路，誘導(dǎo)成骨分化，改善新生骨痂骨密度及微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨折愈合。然而Cal對(duì)骨折愈合的促進(jìn)作用還可能涉及破骨細(xì)胞分化等其他機(jī)制，值得進(jìn)一步探究。