招文華 任輝 沈耿楊 尚奇 張志達 余翔 陳弘林 張鵬 陳桂鋒 余富勇 湯凱 江曉兵 梁德 張玉新 唐軍偉*

1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405 3.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆 喀什 844000

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是一種使用糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)后導致骨強度下降和骨折風險增高的骨骼系統(tǒng)疾病，是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1]。研究表明，在接受長療程GC治療的患者中，超過10%診斷為骨折，30%～40%具有放射學證據(jù)的椎體骨折，給社會造成了沉重的經(jīng)濟負擔[2-3]。GIOP的骨代謝紊亂主要表現(xiàn)為成骨抑制，自噬的過度激活及Wnt/β-catenin信號通路表達下調(diào)在該過程中扮演了重要角色，然而其相關調(diào)控機制仍不甚明確[1,4-5]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex，mTORC1)是細胞內(nèi)存在的一種復合物，Raptor是該復合物中的關鍵蛋白，既往研究常通過檢測Raptor來反映mTORC1的表達[6-7]。研究證實，mTORC1是自噬的上游抑制因子[8]，然而mTORC1是否通過抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導激素環(huán)境下成骨分化的過程仍然未知。為明確相關機理，本研究針對前成骨細胞MC3T3-E1開展相關的體外實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞：前成骨細胞MC3T3-E1購于廣州市源井生物有限公司，傳至第三代用于本實驗。

1.1.2試劑：MHY1485(Sigma公司，美國)，α-MEM基礎培養(yǎng)基Gibco公司，美國)，青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco公司，美國)，谷氨酰胺(Gibco公司，美國)，抗壞血酸(Sigma公司，美國)，β甘油磷酸二鈉(Sigma公司，美國)，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司，中國上海)，茜素紅染液(Cyagen Biosciences，中國廣州)，RNA 提取試劑盒(Takara公司，日本)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix(Takara公司，日本)，熒光定量SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara公司，日本)，BCA 蛋白定量檢測試劑盒(天根生物公司，中國北京)。

1.1.3儀器：ZHJH-C1109C型 CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，CFX96型實時熒光定量PCR(Real-time PCR)儀(Bio-Rad公司，美國)，DMI300B型熒光倒置顯微鏡(Leica公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1MC3T3-E1細胞培養(yǎng)：將MC3T3-E1接種于含10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素雙抗，1%谷氨酰胺的α-MEM完全培養(yǎng)基，并置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至80%融合度時傳代。

1.2.2分組、成骨誘導和給藥：將細胞分為3組：對照組、DEX組、DEX+mTORC1激活劑組。其中DEX為1 μmol/L，mTORC1激活劑為10 μmol/L的MHY1485。對照組加入成骨誘導液，DEX組予成骨誘導液及1 μmol/L DEX進行干預，DEX+mTORC1激活劑組予成骨誘導液、1 μmol/L DEX及10 μmol/L MHY1485進行干預。每3 d更換一次培養(yǎng)基。

1.2.3ALP和ARS染色法檢測成骨能力：在干預的第7天和第14天分別對各組細胞進行ALP和ARS染色。ALP 染色按照ALP染色試劑盒操作步驟進行；ARS染色步驟：藥物干預結(jié)束后，吸棄完全培養(yǎng)基并用PBS沖洗，每孔加入4%多聚甲醛2 mL固定30 min，隨后吸棄多聚甲醛后用PBS沖洗，每孔加入ARS 染液1 mL，3 min后吸棄ARS染液并用PBS沖洗，在顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.4RT-PCR：提取干預第7天的細胞的RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并按照試劑盒步驟進行擴增。最后測得PCR反應的Ct值，以2-ΔΔCt值作為mRNA相對表達量。Raptor、Beclin-1、Atg5、Wnt3、β-catenin、Runx2、GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，引物序列見表 1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.5Western blot：通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)解析每個樣品的均等蛋白(30 μg)，并電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用5%無脂牛奶封閉，然后與Raptor、Beclin-1、Atg5、Wnt3、β-catenin、Runx2和β-actin在4℃下以1∶1000稀釋過夜，然后在室溫下與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶1000)雜交1 h。將膜用TBST洗滌3次，并使用增強的化學發(fā)光試劑盒進行觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組MC3T3-E1細胞的ALP染色比較

與對照組相比，DEX組的ALP染色陽性率明顯降低，顏色較淺；與DEX組相比，DEX+mTORC1激活劑組的ALP染色陽性率顯著升高，顏色深染。見圖1。

圖1 各組MC3T3-E1細胞的ALP染色比較Fig.1 Comparison of ALP staining of MC3T3-E1 cells between each group

2.2 各組MC3T3-E1細胞的ARS染色比較

ARS染色結(jié)果顯示，干預第14天，DEX組的ARS染色陽性率明顯低于Con組；與DEX組比較，DEX+mTORC1激活劑組ARS染色陽性率增加。見圖2。

圖2 各組MC3T3-E1細胞的ARS染色比較Fig.2 Comparison of ARS staining of MC3T3-E1 cells between each group

2.3 各組MC3T3-E1細胞的PCR結(jié)果比較

如圖3所示，與對照組相比，DEX組成骨相關基因Runx2 mRNA表達下降(P<0.05)，說明DEX抑制MC3T3-E1的成骨分化，且mTORC1組成中的關鍵基因Raptor的mRNA水平下降(P<0.05)，自噬相關基因Beclin-1、Atg5 mRNA水平上升(P<0.05)，說明DEX下調(diào)mTORC1水平并誘導MC3T3-E1自噬，而Wnt3、β-catenin mRNA表達下降(P<0.05)。與DEX組相比，DEX+mTORC1激活劑組Raptor、Wnt3、β-catenin、Runx2 mRNA表達上調(diào)(P<0.05)，而Beclin-1、Atg5 mRNA表達下降(P<0.05)，表明應用mTORC1激活劑后抑制自噬并上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，從而挽救DEX對MC3T3-E1向成骨細胞分化的抑制作用。

圖3 各組MC3T3-E1細胞的PCR結(jié)果比較Fig.3 Comparison of PCR results of MC3T3-E1 cells between each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各組MC3T3-E1細胞的WB結(jié)果比較

與對照組相比，DEX組成骨相關基因Runx2蛋白表達下降(P<0.05)，mTORC1組成中的關鍵基因Raptor的蛋白質(zhì)水平下降(P<0.05)，自噬相關基因Beclin-1、Atg5蛋白質(zhì)水平上升(P<0.05)，而Wnt3、β-catenin蛋白質(zhì)表達下降(P<0.05)。與DEX組相比，DEX+mTORC1激活劑組Raptor、Wnt3、β-catenin、Runx2蛋白質(zhì)表達上調(diào)(P<0.05)，而 Beclin-1、Atg5蛋白質(zhì)表達下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組MC3T3-E1細胞的WB結(jié)果比較Fig.4 Comparison of WB results of MC3T3-E1 cells between each group注：A為Con組，B為DEX組，C為DEX+MHY1485組

3 討論

骨穩(wěn)態(tài)主要由破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成維持，該過程的動態(tài)平衡是保證骨重塑的關鍵[9]。持續(xù)性骨形成下降是激素誘導GIOP發(fā)生的主要特征之一，目前認為激素主要通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ受體2和抑制Wnt/β-catenin信號通路對成骨細胞產(chǎn)生抑制作用[1,10]。自噬是細胞降解損壞的蛋白質(zhì)或細胞器并將其循環(huán)利用的過程，對于維持細胞壽命具有重要生理意義[11-12]。研究表明，mTORC1介導自噬的過度激活是GIOP的關鍵病理基礎[4,6]，且有研究證實mTORC1可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導腫瘤的發(fā)生[13-14]，然而相關機制在GIOP的發(fā)病中尚未見報道。本研究針對前成骨細胞MC3T3-E1，探索在激素環(huán)境下mTORC1是否通過抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導MC3T3-E1的成骨分化。

ALP活性是成骨細胞早期的重要表型標志物，直接反映了成骨細胞的活性，而ARS染色主要用于評價成骨細胞分化后期礦化程度[15]。本研究中，與對照組相比，DEX組的ALP染色及ARS染色均明顯變淺，表明1 μmol/L的DEX顯著抑制MC3T3-E1的成骨分化及礦化，與既往研究一致[16-17]。而在DEX+mTORC1激活劑組中，應用mTORC1激活劑后，ALP染色及ARS染色均較DEX組變深，表明mTORC1激活后可緩解DEX對MC3T3-E1的成骨分化及礦化的抑制作用。

Runx2是成骨細胞分化早期的主要轉(zhuǎn)錄因子，并且與成骨細胞分化后期成骨細胞標記基因及相關蛋白的表達密切相關[16,18]。本研究中，與對照組相比，DEX組Runx2 mRNA與蛋白質(zhì)表達下降，表明1 μmol/L的DEX顯著抑制MC3T3-E1的成骨分化，而mTORC1激活后可緩解DEX對MC3T3-E1的成骨分化的抑制作用，表現(xiàn)為Runx2 mRNA與蛋白質(zhì)表達上調(diào)。

生理性自噬對于維持細胞壽命、促進機體生長發(fā)育具有重要意義，然而自噬的過度激活則導致不利的結(jié)局[19-20]。本研究應用1 μmol/L DEX處理MC3T3-E1，出現(xiàn)較對照組降低的Raptor mRNA和蛋白質(zhì)表達，而自噬相關基因Beclin-1、Atg5 mRNA則顯著升高，表明自噬過度激活且自噬的上游抑制因子mTORC1下調(diào)，同時該過程中伴隨著Wnt/β-catenin信號通路相關基因Wnt3、β-catenin mRNA及蛋白質(zhì)的表達下降。這與既往研究中，DEX抑制mTORC1表達、促進自噬及抑制Wnt/β-catenin信號通路的結(jié)果相一致[7,16]。為了證實mTORC1抑制自噬后是否能夠調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導激素對MC3T3-E1成骨分化的影響，本研究應用mTORC1激活劑干預被1 μmol/L DEX處理過的MC3T3-E1，發(fā)現(xiàn)mTORC1組成中的關鍵基因Raptor mRNA及蛋白質(zhì)表達顯著上調(diào)，自噬相關基因Beclin-1、Atg5 mRNA顯著下調(diào)，而Wnt/β-catenin信號通路關鍵基因Wnt3、β-catenin mRNA及蛋白質(zhì)的表達上升，逆轉(zhuǎn)了DEX對上述調(diào)控因子的作用，重新激活MC3T3-E1的成骨分化，證實在激素環(huán)境下，mTORC1通過抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導前成骨細胞MC3T3-E1向成骨細胞分化。

本研究再次證實激素抑制前成骨細胞MC3T3-E1向成骨細胞分化，該過程中伴隨著mTORC1下調(diào)、自噬激活及Wnt/β-catenin信號通路抑制，并且應用mTORC1激活劑首次證實了mTORC1抑制自噬調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路介導前成骨細胞MC3T3-E1向成骨細胞分化的作用機理，溝通了自噬與Wnt/β-catenin信號通路在GIOP發(fā)病中的關鍵作用。然而，本研究局限于細胞水平，需要進一步的動物實驗驗證。