萬(wàn)珊珊 孫曉冬 閆 磊

牡丹江醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江牡丹江 157011

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、對(duì)放療和化療抵抗并容易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1-2]。腦膠質(zhì)瘤是由大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞惡變產(chǎn)生的，也是人腦原發(fā)性腫瘤中最常見(jiàn)的類型，包括星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和室管膜瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤分為4 個(gè)等級(jí)，包括毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（Ⅰ級(jí)）、彌散性星形細(xì)胞瘤（Ⅱ級(jí)）、間變性星形細(xì)胞瘤（Ⅲ級(jí)）以及多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Ⅳ級(jí)）[3]。中藥治療作為新的治療方法越來(lái)越被關(guān)注。甘草查爾酮A 是從甘草根中提取出來(lái)的黃酮類化合物，具有多種藥理學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生蟲(chóng)及成骨活性、免疫調(diào)節(jié)、解痙攣等，目前最受關(guān)注的是甘草查爾酮A 的抗腫瘤活性[4]。本實(shí)驗(yàn)選取人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討甘草查爾酮A對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 細(xì)胞系

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。

1.2 主要儀器與試劑

5417R 臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Ep-pendorf 生命科學(xué)公司）；JYH27020 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；ELX800 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 儀器公司）。

甘草查爾酮A，純度＞98%，購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；MTT 試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)invitrogen 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

復(fù)蘇人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，將人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞分為四組（n=20），對(duì)照組予以等量0.9% NaCl 處理，甘草查爾酮A 低劑量組予以15 μmol/L 甘草查爾酮A處理，甘草查爾酮A 中劑量組予以30 μmol/L 甘草查爾酮A 處理，甘草查爾酮A 高劑量組予以45 μmol/L 甘草查爾酮A 處理，干預(yù)48 h。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞培養(yǎng)至含10%胎牛血清、含100 U/L 青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔1～2 d 用胰蛋白酶?jìng)鞔? 次。

1.4.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按20 000 個(gè)/ml 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板上，體積100 μl/孔，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞80%融合后，按照分組與給藥方法處理細(xì)胞，接種48 h 后，取96 孔板行噻唑藍(lán)比色法（methyl thiazolyl tetrazolium colorimetry method，MTT）檢測(cè)。每孔加MTT 溶液20 μl，37℃避光培育，4 h 棄孔內(nèi)上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶后用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm 處細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值。

1.4.3 檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表達(dá)水平 以實(shí)時(shí)熒光定量（real-time fluorescence quantification，PCR）法檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表達(dá)水平。根據(jù)GeneBank的β-catenin 和Cyclin D1序列，利用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)可擴(kuò)增的產(chǎn)物。引物序列：β-catenin 正向引物5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，反向引物5′-TGCATATGTCGCCACACC-3′；Cyclin D1正向引物5′-GTCACCTAGCAAGCTGCCGAACC-3′，反向引物5′-CGACAGACAAAGCGTCCCTCAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物5′-CAACGAATTTGGCTACAG CA-3′，反向引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。

反應(yīng)體系：cDNA 模板2 μl，正、反向引物（20 μmol/L）各0.8 μl，dH2O 6.4 μl，SYBR Green 10 μl，總體積20 μl。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸10 min，共40 個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸7 min。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量用內(nèi)參GAPDH基因進(jìn)行均一化，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 檢測(cè)各組目的蛋白表達(dá)水平 以蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)各組的增殖細(xì)胞核抗原-67（proliferative nuclear antigen Ki-67，Ki-67）、B 淋 巴細(xì)胞瘤-2（B lymphoma-2，Bcl-2）表達(dá)水平。收集各組后細(xì)胞裂解，離心速率為12 000 r/min，離心半徑為10 cm，離心10 min。二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，孵育30 min，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)，以GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算各個(gè)樣本目的蛋白條帶與GAPDH 條帶的灰度比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS for windows 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后OD 值的比較

MTT 結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的OD 值均低于對(duì)照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的OD 值均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的OD 值低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表1 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后OD 值的比較（±s）

表1 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后OD 值的比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與甘草查爾酮A 低劑量組比較，bP＜0.01；與甘草查爾酮A 中劑量組比較，cP＜0.01

組別 例數(shù) OD對(duì)照組甘草查爾酮A 低劑量組甘草查爾酮A 中劑量組甘草查爾酮A 高劑量組20 20 20 20 0.83±0.03 0.67±0.05a 0.42±0.04ab 0.30±0.01abc

2.2 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)水平的比較

RT-qPCR 結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。

表2 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)水平的比較（±s）

表2 四組人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)水平的比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與甘草查爾酮A 低劑量組比較，bP＜0.01；與甘草查爾酮A 中劑量組比較，cP＜0.01

組別 例數(shù) β-catenin mRNA Cyclin D1 mRNA對(duì)照組甘草查爾酮A 低劑量組甘草查爾酮A 中劑量組甘草查爾酮A 高劑量組20 20 20 20 0.56±0.03 0.40±0.06a 0.29±0.04ab 0.21±0.01abc 0.86±0.09 0.65±0.10a 0.46±0.08ab 0.39±0.01abc

2.3 四組細(xì)胞Ki-67、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較

Western blot 結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。

表3 四組細(xì)胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 四組細(xì)胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與甘草查爾酮A 低劑量組比較，bP＜0.01；與甘草查爾酮A 中劑量組比較，cP＜0.01

組別 例數(shù) Ki-67 Bcl-2對(duì)照組甘草查爾酮A 低劑量組甘草查爾酮A 中劑量組甘草查爾酮A 高劑量組20 20 20 20 0.98±0.02 0.79±0.08a 0.66±0.03ab 0.34±0.01abc 0.64±0.07 0.55±0.02a 0.40±0.03ab 0.29±0.0abc

3 討論

盡管目前腦膠質(zhì)瘤治療技術(shù)有了較大進(jìn)步，患者預(yù)后有了較大改善，但腦膠質(zhì)瘤的治療仍缺乏突破性進(jìn)展[5-7]。腦膠質(zhì)瘤治療以手術(shù)為首選，但由于腦膠質(zhì)瘤具有浸潤(rùn)生長(zhǎng)的特性，與腦組織間無(wú)明顯邊界，難以做到全部切除，必須輔以術(shù)后放、化療殺傷殘余腫瘤細(xì)胞。膠質(zhì)瘤的化療依然存在許多局限性，因此急需革新治療理念，研發(fā)新型藥物來(lái)有效殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)率及死亡率，提高生活質(zhì)量以及改善預(yù)后等。探索新的治療藥物抑制腦膠質(zhì)瘤已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，中藥治療將具有非常好的前景。

甘草為我國(guó)中醫(yī)藥學(xué)中常見(jiàn)的補(bǔ)氣類藥用植物，其藥性平和通行十二經(jīng)脈，有調(diào)和諸藥、解毒、補(bǔ)虛、止咳潤(rùn)肺等多種功能，為常用處方藥[8]。甘草首載于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，有悠久的藥用歷史。中醫(yī)處方離不開(kāi)甘草，有“十方九草”之說(shuō)。甘草的主要成分是三萜類化合物和黃酮類化合物[9]。甘草查爾酮A是傳統(tǒng)中藥甘草的主要成分，其抗腫瘤活性正在成為研究熱點(diǎn)[10-12]。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，是一條極其保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與胚胎發(fā)育及細(xì)胞增殖與分化等正常生理過(guò)程，同時(shí)，Wnt/β-catenin 通路也是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵性通路之一，在很多腫瘤中過(guò)渡激活，包括腦、乳腺、結(jié)腸、皮膚和肝臟等[13-17]。β-catenin 是Wnt/βcatenin 通路的正性調(diào)控因子，生理狀態(tài)下主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，參與介導(dǎo)同型細(xì)胞之間的粘連。Wnt/βcatenin 通路在腫瘤細(xì)胞內(nèi)被激活后促使β-catenin轉(zhuǎn)移，致下游靶基因c-myc、MMP-7 等活化，從而促使腫瘤進(jìn)展。β-catenin 也是腫瘤干細(xì)胞增殖所必需的因素[18]。Wnt/β-catenin 通路的異常激活促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲，而阻斷Wnt/β-catenin 信號(hào)通路除可以抑制腫瘤的遷移、侵襲和血管生成之外，還可能調(diào)節(jié)腫瘤的化療敏感性[19-20]。Cyclin D1是Wnt/βcatenin 信號(hào)通路的下游原癌基因，它控制著細(xì)胞周期從G1 期向S 期的轉(zhuǎn)變，主要促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，甘草查爾酮A 低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于甘草查爾酮A 低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于甘草查爾酮A中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這表明了甘草查爾酮A 可能通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖。

增殖細(xì)胞核抗原Ki-67 是細(xì)胞作為細(xì)胞周期中核抗原的決定簇，在細(xì)胞周期中所有處于活動(dòng)期的細(xì)胞均可表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中廣泛應(yīng)用作為處于增殖狀態(tài)的標(biāo)志物。Bcl-2 能夠抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，屬于抗凋亡基因[20]。本研究結(jié)果顯示，甘草查爾酮A低劑量組、甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，甘草查爾酮A 中劑量組和甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均低于甘草查爾酮A低劑量組，甘草查爾酮A 高劑量組的Ki-67、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平低于甘草查爾酮A 中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這表明了甘草查爾酮A 可能通過(guò)Ki-67 和Bcl-2 蛋白抑制人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。

綜上所述，甘草查爾酮A 對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，其機(jī)制可能與下調(diào)β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA、Ki-67 和Bcl-2 表達(dá)水平有關(guān)。腫瘤增殖是腫瘤患者致死的最直接原因，本實(shí)驗(yàn)提示中藥治療腦膠質(zhì)瘤可能發(fā)揮較好作用，這為腦膠質(zhì)瘤的治療提供了一個(gè)新的方向。