吳白芬，尚 李，尚 怡，劉 錄，何芳雁，周志宏，浦仕彪

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省高校中藥飲片工程研究中心，云南 昆明 650500)

現(xiàn)代社會造就了許多新物質(zhì)，方便人們生活的同時也引入了諸多過敏原，導(dǎo)致越來越多的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，最常見和多發(fā)的就是反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的濕疹[1-2].濕疹劇烈瘙癢嚴(yán)重影響生活質(zhì)量.嬰幼兒由于機體免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，皮膚屏障功能不完善，更容易發(fā)生大面積濕疹，而大劑量使用糖皮質(zhì)激素和抗組胺藥物的對癥治療對患兒生長發(fā)育構(gòu)成潛在安全隱患，極大地增加了家長的精神負(fù)擔(dān)，迫切需要尋找更安全、有效的治療手段[3-5].中醫(yī)藥外治嬰幼兒濕疹作用直接、療程短、副反應(yīng)小，可緩解臨床癥狀，有效改善皮損，避免外用激素的不良反應(yīng)，并在一定程度上可控制疾病復(fù)發(fā)，故越來越受到重視[6].本文采用DNFB復(fù)制小鼠慢性濕疹模型，探討4種臨床驗方對濕疹的療效及初步作用機制，為臨床應(yīng)用和深度開發(fā)提供實驗依據(jù).

1 實驗材料

1.1 受試樣品

方劑1(1#)，由顯齒蛇葡萄、桑白皮及三七等組成；方劑2(2#)，由顯齒蛇葡萄、桑白皮及全蝎等組成；方劑3(3#)，由白鮮皮、紫草及全蝎等組成；方劑4(4#)，由顯齒蛇葡萄、白鮮皮、紫草、桑白皮、三七及全蝎等組成.取各處方藥材，分別加水煎煮3次，合并濾液濃縮至含生藥濃度依次為0.84、0.80、0.80、1.04 g/mL，于4～8 ℃ 冷藏備用.實驗時，各受試藥液分別稀釋5、10倍作為高、低劑量.

1.2 陽性對照

復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(999皮炎平)，華潤三九醫(yī)藥股份有限公司(1706004H)，直接取適量涂于小鼠局部皮膚.兒膚康搽劑，成都森科制藥有限公司(170807)，稀釋2倍為中藥對照的濃度.

1.3 實驗動物

雄性ICR小鼠，6～8周齡，體重24～26 g，成都達碩實驗動物有限公司， 生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2015-030；飼養(yǎng)于IVC動物實驗室，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，照明 12 h：12 h 明暗交替，照度150～300 lx，噪音≤60 dB，使用許可證：SYXK(滇)K2018-0005.

1.4 主要試劑

2,4-二硝基氟苯(DNFB)，中國醫(yī)藥(集團)上海化學(xué)試劑公司(F20120726)；橄欖油，國藥集團化學(xué)試劑有限公司(20160912)；丙酮，天津市富宇精細(xì)化工有限公司(20160626).甲醛，廣東光華科技股份有限公司(20171018)；磷酸二氫鈉(20151222)、磷酸氫二鈉(20170204)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司. IFN-γ、IL- 10 、IL- 2試劑盒(2018010)，北京四正柏生物科技有限公司；IL- 6試劑盒(T10017038)，武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司.

1.5 主要儀器

ADVENURERTM電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；全波長酶標(biāo)儀，ThermoFisher集團；Biofuge冷凍離心機，Thermo公司；Milli-Q超純水機，Merch Millipore德國；XK96-A快速混勻器，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司.

2 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析法；方差齊采用LSD法檢驗，方差不齊采用Tamhane′s法檢驗；P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01有顯著統(tǒng)計學(xué)意義.

3 實驗方法

3.1 模型制備與給藥

選取24～26 g 雄性小鼠，實驗前日(0 d)腹部剪毛、背部脫毛約 2 cm×3 cm，除隨機抽取10只脫毛小鼠為正常對照外，其余各鼠均于腹部涂抹2%的DNFB溶液 0.1 mL，試驗當(dāng)日(1 d)再強化致敏1次.將造模小鼠隨機分為11組，見表1.各組動物于2次致敏后 4 h 開始于背部脫毛處及雙耳內(nèi)外涂布給藥，每日2次，連續(xù) 21 d.第6天上午給藥后 1 h，除正常對照組外各組小鼠均用0.5%DNFB 50 μL 于背部脫毛處均勻涂抹進行攻擊，以后每5天重復(fù)上述激發(fā)過程，共激發(fā)3次.末次激發(fā)后5日給藥 1 h 后，用0.5% DNFB 30 μL 涂抹小鼠右耳內(nèi)外，左耳涂抹 30 μL 丙酮-橄攬油溶液為對照，6 h 后再次涂耳給藥1次.耳部激發(fā) 24 h 后眼眶取血、取雙耳和胸腺及脾臟，分別用于相關(guān)指標(biāo)檢測.

3.2 觀察指標(biāo)測定

試驗期間，觀察模型制備前后對各組小鼠體重、毛色、飲食、活動等一般狀況有無影響.每次激發(fā)后 2 d，對小鼠背部接觸性皮炎癥狀進行評分(標(biāo)準(zhǔn)：有結(jié)痂及滲出為4分；有明顯紅斑、水腫及滲出為3分；紅斑、水腫伴少量滲出為2分；輕度紅斑、水腫無滲出為1分；正常為0).耳部激發(fā)后 24 h 眼眶采血，3 000 r/min 離心 10 min，分離血清，測定IFN-r、IL-2、IL-10、IL-6水平.取血后脫頸椎處死小鼠，沿雙耳基線剪下耳片，用 8 mm 打孔器于雙耳同部位等面積切下，稱重，以2耳片重量之差作為腫脹度；取背部皮膚及右耳置入10%福爾馬林溶液中固定，用于病理組織學(xué)檢查；摘取胸腺、脾臟稱重，計算臟器系數(shù).

4 試驗結(jié)果

4.1 一般觀察

與正常組相比，模型組小鼠激發(fā)后背部皮膚大面積紅斑，并逐漸增厚、粗糙、干燥，有血痂，常搔抓、躁動；與模型組相比，各給藥組小鼠皮膚紅斑及增厚減輕，少干燥，較安靜；皮炎平組小鼠較模型組皮膚明顯變薄，有皺褶現(xiàn)象，紅斑明顯，激發(fā)部位無毛發(fā)生長,結(jié)果見表1.

由表1可見，首次激發(fā)后 2 d，模型組小鼠背部皮膚損傷的評分顯著高于正常對照組，除皮炎平組能明顯降低模型小鼠皮膚評分外，其余各給藥組與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異；2次激發(fā)后，模型組小鼠皮膚損傷評分持續(xù)升高，除1#、2#和4#高劑量組僅有作用趨勢外，其余各組均能明顯降低模型小鼠的皮膚評分；3次激發(fā)后，模型組小鼠皮膚損傷評分繼續(xù)升高，所有給藥組均能明顯降低模型小鼠的皮膚評分.給藥結(jié)束，除皮炎平組小鼠體重比模型組明顯減輕外，其余各組體重與模型組相比無明顯差異.

表1 對慢性濕疹小鼠皮損評分及體重的影響

4.2 對耳腫脹度及免疫器官系數(shù)的影響

與模型組相比，各給藥組連續(xù)局部涂藥 21 d，均可顯著抑制DNFB誘導(dǎo)小鼠的耳腫脹，不同程度降低胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù).其中，除2#高劑量和兒膚康組外，各給藥組均能明顯降低模型小鼠的胸腺系數(shù)；除皮炎平、兒膚康、1#和4#高劑量組能明顯降低脾臟系數(shù)外，其余各組對脾臟系數(shù)僅有降低趨勢而無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表2.

4.3 對血清細(xì)胞因子的影響

與模型組相比，所有給藥組均能明顯降低模型動物的IFN-γ和IL-6水平；不同程度提高IL-10水平，除兒膚康和4#樣品高劑量組對IL-10水平的提升作用接近統(tǒng)計學(xué)差異外，其余給藥組均能明顯提高模型小鼠血清IL-10水平，但對IL-2水平無明顯影響，詳見表3.

表2 對慢性濕疹小鼠耳廓腫脹度及免疫器官系數(shù)的影響

表3 對慢性濕疹小鼠血清細(xì)胞因子的影響

4.4 組織病理學(xué)檢查

4.4.1 耳廓皮膚病理改變

由圖1可見，對照組小鼠耳廓皮膚鱗狀上皮、角化層、皮下組織均正常；與正常組相比，模型組鱗狀上皮增厚，細(xì)胞明顯水腫，真皮層大面積重度水腫、增厚，血管明顯擴張充血，大量炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤；各給藥組能減輕炎癥細(xì)胞的浸潤，改善耳片組織病理學(xué)，表現(xiàn)為：耳廓組織水腫及增厚面積較小，血管擴張及充血較輕，炎細(xì)胞彌漫性浸潤較模型組有不同程度減輕.

4.4.2 背部皮膚病理改變

由圖2可見，對照組小鼠背部皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，未見增厚及炎細(xì)胞浸潤等病理改變；與正常對照組相比，模型組可見表皮增厚明顯，角質(zhì)層、棘層、顆粒層明顯增厚，且表皮突明顯下延，角質(zhì)層角化過度，真皮層毛細(xì)血管擴張充血及炎細(xì)胞大量浸潤；各給藥組皮損病變均較模型組明顯減輕，表現(xiàn)為：表皮、角質(zhì)層、棘層、顆粒層增厚及炎細(xì)胞浸潤程度較模型組有所減輕.

圖1 耳廓皮膚組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE 10×)

圖2 皮膚組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE 10×)

5 討論與小結(jié)

嬰兒濕疹是一種慢性反復(fù)發(fā)作的炎癥性皮膚病，Th1 /Th2 免疫功能失衡是導(dǎo)致濕疹發(fā)生的關(guān)鍵因素[9].正常情況下 Th1細(xì)胞和Th2 細(xì)胞處于一種動態(tài)平衡狀態(tài).但在諸多復(fù)雜因素刺激下，Th1/Th2 細(xì)胞亞群會失去平衡，引起免疫調(diào)節(jié)機制紊亂[10]，所產(chǎn)生的炎癥因子會對靶器官造成一定損害，從而導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[11]，如誘發(fā)濕疹.Th1細(xì)胞是遲發(fā)超沒反應(yīng)中的效應(yīng)T細(xì)胞，Th2 細(xì)胞的主要作用是增強B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，兩者均在皮膚變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)為Th1細(xì)胞的因子(如IL-2、TNF-α、IFN-γ等)升高，Th2細(xì)胞的因子(如IL-4、IL-6、IL-10等)降低，且Th1/Th2 的失衡與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[12].所以可以通過檢測Th1/Th2 的失衡情況衡量濕疹的轉(zhuǎn)歸.本研究成功復(fù)制DNFB誘發(fā)小鼠慢性濕疹模型，對4種臨床使用的經(jīng)驗方進行藥效學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)各方劑樣品均可明顯抑制慢性濕疹模型小鼠的耳組織腫脹(炎癥)，改善背部皮膚及耳片皮膚組織的病理學(xué)變化，抑制胸腺和脾臟系數(shù)，降低血液中IFN-γ和IL-6的水平，提高抑制免疫反應(yīng)的IL-10水平，提示其對慢性濕疹的治療作用機制可能與對免疫器官的抑制及調(diào)節(jié) Th1/Th2 細(xì)胞亞群的平衡有關(guān)，其深入的作用機制有待于進一步研究.