高梓琪，滿佳旭，武思敏，袁 梅，黃業(yè)偉，張冬英

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

茶的藥理作用在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就被提到：“神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得茶而解之”，直至今天，也是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn).茶中生物堿類屬嘌呤堿類，是茶中重要功效成分之一，常見的包含咖啡堿、可可堿和茶堿.

茶堿(二甲基黃嘌呤)主要存在于茶和可可豆中.茶葉中茶堿最先是在1889年，被德國科學(xué)家Albrecht Kossel發(fā)現(xiàn)，1896年德國學(xué)者WihelmTraube通過化學(xué)方法合成得到，最初用作利尿劑，后來確定其支氣管擴(kuò)張劑的特性，并于1922年作為哮喘的臨床治療引入，現(xiàn)在藥用茶堿是工業(yè)合成的[2-4].

在體內(nèi)，約90%的茶堿是從肝臟排泄，從腎臟排泄約占10%，關(guān)鍵消除酶是肝臟中的混合功能氧化酶系，主要是細(xì)胞色素P450超家族(CYP).茶堿口服吸收相對安全性好，生物利用度高達(dá)96%，但治療窗窄，血藥濃度需控制在10～20 μg/mL 范圍時(shí)療效最好，不良反應(yīng)少.所以盡管其在全球廣泛使用并且使用歷史長，但在許多工業(yè)化國家，茶堿只是作為部分疾病控制不佳患者的附加療法，因?yàn)槲毽?激動(dòng)劑作為支氣管擴(kuò)張劑更有效，吸入皮質(zhì)類固醇具有更強(qiáng)的抗炎作用.茶堿用作口服療法(快速或緩釋片劑)或更可溶的氨茶堿，乙二胺鹽，適合口服和靜脈內(nèi)使用[5-6].

另外，茶堿具有利尿作用，并且可以增加心排血量；具有改善氣道黏膜的纖毛清除作用；能增強(qiáng)呼吸肌特別是膈肌和肋間肌的力量，增強(qiáng)低氧呼吸驅(qū)動(dòng)，抵抗低氧呼吸抑制，改善通氣以增強(qiáng)呼吸功能；能直接使呼吸中樞興奮，防止呼吸衰竭；另外還具有抑制血小板活性和微循環(huán)血管通透性的作用.

1 茶堿的常用檢測方法

生物堿是茶葉中的重要組成物質(zhì)，茶樹中生物堿含量，因其在茶樹中部位不同，含量差異較大，例如，在生長旺盛的嫩芽中，含量是最高的，粗老葉和茶梗中含量較少，茶籽中幾乎不含.另外，其含量還與陽光、施肥、生長季節(jié)、品種等都有關(guān)系.例如，紅茶和綠茶多用春季新嫩的茶葉，故茶堿含量偏高；鐵觀音屬烏龍茶，多以成熟的茶葉制做，故茶堿含量較低.除此之外，可能還與摘取茶葉的地點(diǎn)，茶葉產(chǎn)地等都有關(guān)系.

直接測定茶葉中的茶堿的文獻(xiàn)較少，多數(shù)研究為血藥濃度或藥物制劑中茶堿的含量測定，因茶堿溶解度低，做藥劑使用時(shí)一般選擇茶堿衍生物，常用茶堿與乙二胺復(fù)鹽，即氨茶堿，乙二胺增加藥物水溶性，其藥理作用主要為茶堿或者新一代黃嘌呤衍生物多索茶堿(圖1)，其第7位具有二氧戊環(huán)亞甲基基團(tuán)，具有很好的藥理學(xué)作用.鑒于茶堿的藥用有效濃度與毒性濃度較為接近，如何快速且準(zhǔn)確的檢測茶堿含量一直是研究的熱點(diǎn).并且在液相、毛細(xì)管電泳等傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展出了很多基于不同原理的方法.根據(jù)原理可分為色譜法、光譜法、電化學(xué)法、多種方法聯(lián)用等.

圖1 茶堿和多索茶堿的結(jié)構(gòu)圖

1.1 色譜法

色譜法利用樣品中不同組分在固定相與流動(dòng)相中受到的作用力不同，而將各組分分離，并檢測各組分含量.在近代分析化學(xué)中，它是發(fā)展最快應(yīng)用最廣的分離分析技術(shù).在茶堿的檢測方法中也有著不可替代的地位.

高效液相色譜法是茶堿檢測方法中最成熟也是最權(quán)威的一種.為了探究飲茶人群如何合理使用茶堿類藥物，王國欽等[1]利用Accurasil C18柱子在 38 ℃ 柱溫的條件下，使用甲醇和水做流動(dòng)相分析了西湖龍井、壽眉、清香810等15種不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的茶葉.經(jīng)測定，實(shí)驗(yàn)中的15種茶葉茶堿含量在0.19～1.27 mg/g 之間，不同茶葉的茶堿含量具有一定差異.來自第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所的肖會(huì)敏等[7]用梯度洗脫的方法(流動(dòng)相A：甲醇(0 min，5%→80 min，75%→100 min，5%)B相：水)，在 35 ℃ 的柱溫，199 nm 檢測波長的條件下同時(shí)完成了茶葉中茶氨酸、茶堿與咖啡因的檢測，大大提高了檢測的效率.劉志彬等[8]同樣使用了梯度洗脫的方法同時(shí)分析了10種典型武夷巖茶(5種肉桂和5種水仙)的咖啡堿、可可堿和茶堿的含量，發(fā)現(xiàn)其含量均低于綠茶、鐵觀音和紅茶，并且在 60 s 沸水沖泡后僅有50.15%茶堿溶于茶湯中.黃永蓮等[9]使用高效液相色譜法對9種常見的綠茶中茶堿和咖啡因的含量進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)茶堿的含量相較咖啡因而言更容易受到產(chǎn)地氣候的影響.喬小燕等[10]用高效液相的方法對云南白鶯山10個(gè)古茶樹群落的曬青毛茶中的茶堿含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明其茶堿干重含量在0.30～0.84 mg/g，與烏龍茶、綠茶和南昆山白毛茶接近，在0.03%～0.08%之間，明顯低于云南勐海地區(qū)古樹茶.

1.2 光譜法

自然界的大部分物質(zhì)在受到光的作用后均會(huì)產(chǎn)生光信號(hào)或者是光信號(hào)的變化，接收、檢測和處理這些信號(hào)的變化，從而獲得待測物質(zhì)的定性和定量信息.作為現(xiàn)代儀器分析中應(yīng)用十分廣泛的一類方法在茶堿含量的測定方面同樣得到應(yīng)用.

張立科等[11]發(fā)現(xiàn)在弱堿性介質(zhì)中，茶堿能顯著增強(qiáng)雙氧水與魯米諾反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，因此利用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀即可檢測痕量的茶堿，檢測限低到1.0×10-7mol/L.因?yàn)椴枞~中嘌呤生物堿結(jié)構(gòu)上的嘌呤環(huán)具有共軛雙鏈體系，具有獨(dú)特的吸收光譜，在272～274 nm 具有最大吸收值，所以使得紫外分光光度法檢測茶堿含量成為可能.程弘夏等[12]用蒸餾水做提取溶劑建立了基于紫外可見分光光度法的茶堿緩釋片中茶堿濃度的檢測方法.但是該方法應(yīng)用于茶葉中茶堿含量檢測時(shí)具有一定的局限性，因?yàn)槠錂z測的是樣品中嘌呤堿的總量會(huì)受到樣品中咖啡因等嘌呤堿的干擾.

1.3 電化學(xué)方法

電化學(xué)分析方法[13-14]是近現(xiàn)代分析方法的一個(gè)重要組成部分，它可以利用物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律來測定未知物質(zhì)的組成和含量.

氧化石墨烯(GO)和還原氧化石墨烯(RGO)的組成作為甲基黃嘌呤的檢測傳感器(化學(xué)，電化學(xué)和生物傳感器)受到歡迎，在極性溶劑(尤其是水)中的較高溶解度以及對這些目標(biāo)的較高反應(yīng)性[15].Liu等[16]開發(fā)了一種基于單分子光漂白(SMPB)技術(shù)的茶堿的超靈敏傳感平臺(tái)，用于茶堿的檢測，其低檢測限(LOD)為 0.092 nmol/L.Li等[17]利用電化學(xué)的方法制備了1種新型便攜式分子印跡聚合物(MIP)-SERS納米探針，該探針可以特異性的檢測茶堿含量，最低可以檢測 0.01 nmol/L 的茶堿含量，在 8 min 內(nèi)即可完成檢測.Yin等[19]研究基于CdSe微粒改性玻璃碳電極使用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法對茶飲料中的茶堿含量進(jìn)行了測定，在最佳條件下，茶堿的氧化峰電流與其濃度在1～40和40～700 μmol/L 正相關(guān)，檢測下限估計(jì)為 0.4 μmol/L(S/N=3)，此方法顯示出良好的重現(xiàn)性和優(yōu)異的選擇性，可以用于檢測茶及茶飲料中茶堿的含量.

1.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是近代新發(fā)明的一種分離分析技術(shù)，它可以快速、高效、靈敏的完成樣品的檢測.Chen等[18]應(yīng)用毛細(xì)管電泳及電化學(xué)的方法分離和檢測了茶葉中的茶堿、黃嘌呤、次黃嘌呤等3種嘌呤，14 min 內(nèi)同時(shí)完成了茶堿及其他5種嘌呤堿的檢測.雖然毛細(xì)管電泳法的檢測速度較快，但是其靈敏度卻低于高效液相色譜法，當(dāng)進(jìn)樣量太少時(shí)也會(huì)影響其測定的準(zhǔn)確性.

1.5 其他方法

Li等[20]用磁性固相萃取(M-SPE)從綠茶中快速純化生物堿異構(gòu)體(可可堿和茶堿).使用響應(yīng)面方法(RSM)對M-SPE程序進(jìn)行了優(yōu)化，以分析最大條件，發(fā)現(xiàn)以甲醇(80%)為洗液，甲醇∶乙酸(體積比，V/V=8∶2)為洗脫劑，pH為3時(shí)，M-SPE中可可堿和茶堿的最佳回收條件.綠茶中茶堿的實(shí)際回收率分別為87.51%，實(shí)際提取量為 5.07 mg/g.

在檢測過程中由于樣品組分的復(fù)雜程度較高，單一的方法往往不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果，所以檢測方法的聯(lián)用就顯得尤為重要.高效液相色譜可以對復(fù)雜基體化合物進(jìn)行分離，而質(zhì)譜在選擇性、靈敏度、分子量以及結(jié)構(gòu)信息方面的優(yōu)勢使得高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用成為可能.Aqel等[21]開發(fā)了一種基于UHPLC-MS的分析方法，用于快速測定茶葉中的甲基黃嘌呤.在使用等度洗脫由90%水和僅10%乙腈組成，流速為 0.5 mL/ min(3 mL/h 乙腈)的最佳條件下，可在 30 s 內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離.質(zhì)譜儀在ESI+中以SIR模式運(yùn)行.此方法在0.03～5 μg/mL 范圍內(nèi)呈線性，具有簡單，靈敏，高效和綠色的優(yōu)點(diǎn).

Ahmad等[22]首次使用加速溶劑萃取(ASE)萃取甲基黃嘌呤(MX)，并應(yīng)用超高效液相色譜(UHPLC-DAD)定量MX.并證明，ASE在優(yōu)化的溫度(100 ℃)和溶劑(MeOH)條件下有較高的提取率(940.22±192.28)mg/g.該方法在商業(yè)樣品中的應(yīng)用同樣顯示出較高的提取率，其中TH濃度為0～0.55(mg/g).溫度和溶劑變化與樣品的提取率顯示出重要的相關(guān)性.

Chen等[23]提出了一種用于茶堿檢測的電化學(xué)生物傳感器，首先將RNA適體分裂成2個(gè)單鏈RNA探針.一個(gè)與DNA四面體雜交，然后將得到的納米結(jié)構(gòu)固定在金電極上; 另一個(gè)在AuNPs的表面被修飾，AuNPs的表面也被亞甲基藍(lán)(MB)標(biāo)記為電化學(xué)物質(zhì).2種RNA探針與茶堿之間的識(shí)別過程導(dǎo)致AuNPs的定位和MB在電極界面上的富集.因此產(chǎn)生了顯著的電化學(xué)反應(yīng)，由此測得茶堿的濃度.

2 茶堿類藥物的藥理作用

2.1 茶堿的結(jié)構(gòu)與藥理作用的關(guān)系

茶堿(圖1)分子有2個(gè)有效部位，第3位的甲基與平滑肌松弛及其抗炎作用密切相關(guān)，在肌肉和炎癥細(xì)胞中，影響非特異抑制某些環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的活性.第1位的甲基負(fù)責(zé)與腺苷競爭受體，對神經(jīng)肌肉的呼吸效應(yīng)器有利，也產(chǎn)生毒性作用.此外，在治療水平上，茶堿還可提高血漿兒茶酚胺水平[24].茶堿的第3位甲基通過抑制炎性細(xì)胞的PDE和神經(jīng)肽的釋放進(jìn)而發(fā)揮抗炎功效[25]；在免疫調(diào)節(jié)方面，一來茶堿能夠發(fā)揮類似胸腺素的作用，誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化成熟和其功能.二來，茶堿還可以通過抑制PDE，提高cAMP，進(jìn)而抑制細(xì)胞脫顆粒，降低抗原誘導(dǎo)的組胺等物質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功效[26].

2.2 支氣管舒張作用

茶堿類藥物的支氣管舒張作用[27-30]是通過有效抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶實(shí)現(xiàn)的，茶堿血清濃度達(dá)到10～20 mg/L 時(shí)，可以起到對支氣管平滑肌的擴(kuò)張作用，非特異性地抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性，有效增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度水平，抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣離子內(nèi)流，促進(jìn)了鈣離子外流，進(jìn)而達(dá)到降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子，起到擴(kuò)張支氣管平滑肌的作用.但是這個(gè)濃度與中毒濃度非常接近，容易產(chǎn)生副作用.

2.3 抗炎作用

茶堿通過抑制磷酸二酯酶和神經(jīng)肽的釋放發(fā)揮抗炎作用.在適當(dāng)?shù)乃较?，茶堿會(huì)強(qiáng)烈抑制抗原激活的后期反應(yīng)，這與抑制中性粒細(xì)胞的活化和磷酸二酯酶誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)的釋放有關(guān).并且最近的臨床前研究表明，“低劑量”茶堿(血漿水平1～5 mg /L)可以抑制機(jī)體炎性因子高表達(dá)，每天2次口服 0.1 g 茶堿可降低COPD患者的IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-17，TNF-α和C反應(yīng)蛋白(CRP)含量[31].

低劑量的茶堿可抑制炎癥細(xì)胞因子在平滑肌中誘導(dǎo)的ET-1異常表達(dá)，這是其降低哮喘氣道高反應(yīng)性的機(jī)制之一,Bin等[32-34]研究證明茶堿通過上調(diào)HDAC2表達(dá)并減少NF-κB p65活化，對肺氣腫小鼠模型的骨骼肌具有抗炎作用；MitaniTakakazu等[35-36]研究結(jié)果表明，抑制糖皮質(zhì)激素受體(GR)活性進(jìn)而降低促炎性脂肪因子的產(chǎn)生也是茶堿的抗炎途徑之一；此外茶堿還抑制腺苷受體，增加白介素10的釋放，并抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及從外周血到氣道粘膜轉(zhuǎn)移的炎性細(xì)胞和T細(xì)胞的活化，從而起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用.

綜上茶堿具有良好的抗炎作用[37-40]，能夠降低多種炎癥細(xì)胞活力，具有一定的穩(wěn)定炎性細(xì)胞膜作用，抑制多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子進(jìn)入和釋放到氣道中，抑制或減少炎性遞質(zhì)及過氧化物的釋放[41-42].

2.4 免疫調(diào)節(jié)作用

越來越多的研究證明，低劑量的茶堿具有免疫調(diào)節(jié)作用.CD4+具有促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫的作用，而CD8+抑制其反應(yīng)，CD4+/CD8+水平可反映機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性.茶堿能起到調(diào)節(jié)CD4+細(xì)胞的作用，抑制周圍血活化CD8+細(xì)胞向氣道內(nèi)轉(zhuǎn)移，降低氣道內(nèi)CD8+細(xì)胞數(shù)目，并抑制CD8+細(xì)胞相關(guān)的移植和宿主反應(yīng)，從而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用.并且低劑量的茶堿可以激活組蛋白去乙?；富钚?可一定程度上增強(qiáng)糖皮質(zhì)類激素的抗炎作用，有效降低炎性細(xì)胞水平，抑制炎性細(xì)胞的活化和聚集，茶堿還可逆轉(zhuǎn)D2拮抗劑和毒蕈堿激動(dòng)劑引起的運(yùn)動(dòng)障礙，這些同樣說明茶堿起到了一定的免疫調(diào)節(jié)作用[43].

3 展望

作為一種臨床應(yīng)用時(shí)間較長的哮喘治療藥物的茶堿，具有治療效果確切、價(jià)格便宜的特點(diǎn).因?yàn)槠洳涣挤磻?yīng)較多，安全性差等原因在擴(kuò)張支氣管作用方面已退居三線；而近些年隨著研究不斷深入與發(fā)展，一些茶堿類的長效藥物、緩釋藥物，可以通過一次服用，較長時(shí)間的保持有效的血藥濃度，而有效避免了因?yàn)榇髣┝糠枚鴮?dǎo)致的不良反應(yīng)發(fā)生.并且通過對茶堿類藥物進(jìn)一步藥理研究發(fā)現(xiàn)，茶堿類藥物在抗炎、調(diào)節(jié)免疫等方面也具有確切的效果.相信通過繼續(xù)對其不斷探索研究與開發(fā)，茶堿還有廣闊的應(yīng)用與開發(fā)前景.