陳瓊，王珊珊，石繼春，王春娥，李紅，李茂光，葉強(qiáng)

中國(guó)食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

肺炎球菌為一種條件致病菌，是侵襲性肺炎球菌疾病和社區(qū)獲得性肺炎的主要病原菌，也是腦膜炎、菌血癥、急性中耳炎和鼻竇炎的常見病原菌，老人和兒童是肺炎球菌感染的高危人群［1-2］。2015年，全球約有583萬(wàn)5歲以下兒童死亡，其中29.4萬(wàn)是由肺炎球菌感染引起的［3］。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在發(fā)展中國(guó)家，肺炎均是導(dǎo)致老年人死亡的主要原因之一［4-5］。由于肺炎球菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，通過(guò)疫苗接種來(lái)預(yù)防肺炎球菌感染顯得尤為重要［6-7］。

肺炎球菌細(xì)胞壁外層莢膜多糖是其主要毒力因子，具有型特異性，根據(jù)其莢膜多糖結(jié)構(gòu)不同，目前已發(fā)現(xiàn)90多個(gè)血清型［8-9］。莢膜多糖作為23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗和13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗的活性成分，多糖含量測(cè)定是疫苗效力試驗(yàn)的替代指標(biāo)，也是確保肺炎球菌結(jié)合疫苗質(zhì)量有效穩(wěn)定的重要質(zhì)控指標(biāo)之一。目前，《中國(guó)藥典》三部（2020版）中規(guī)定，采用速率比濁法檢測(cè)各型多糖含量［10］，因此建立穩(wěn)定、無(wú)交叉反應(yīng)的肺炎球菌特異性血清國(guó)家參考品是控制肺炎球菌疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)速率比濁法確定1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特異性血清候選參考品的工作濃度、線性范圍、檢測(cè)限、定量限、專屬性和穩(wěn)定性，制備國(guó)家參考品。

1 材料與方法

1.1血清及多糖 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特異性血清候選參考品（編號(hào)分別為：PSS-2018-1、PSS-2018-3、PSS-2018-4、PSS-2018-5、PSS-2018-6B、PSS-2018-7F、PSS-2018-9V、PSS-2018-14、PSS-2018-18C、PSS-2018-19A、PSS-2018-19F和PSS-2018-23F）由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，分裝體積為1 mL／支，-70℃保存；1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎球菌多糖（批號(hào)分別為：1T-BZ20180901、3T-BZ20190101、4T-BZ20180901、5T-BZ20180901、6BT-BZ20180901、7FT-BZ20180901、9VT-BZ20180901、14T-BZ20181001、18CT-BZ20181101、19AT-BZ20181101、19FT-BZ20181101和23FT-BZ2018-0901）由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，500μg／mL，-70℃保存；1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型肺炎球菌特異性血清（批號(hào)分別為：K112M2、M321M1、G411M1、L511M3、B617M1、M712M1、N9d41M1、G1413M2、H1812M2、K19c11M2、L19b21M2和D23b11M2）購(gòu)自丹麥血清研究所；23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗由廠家1（批號(hào)：20190411、20190412和2019-0413）和廠家2（批號(hào)：S003762、S004498和S004574）提供。

1.2主要試劑及儀器 UDR試劑盒、IMMAGE BUF1、IMMAGEDIL1、IMMAGEWashing Solution及雙光徑速率濁度免疫分析系統(tǒng)（IMMAGE 800 Immunochemistry System）均購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.3檢測(cè)方法 選擇雙光徑速率濁度免疫分析系統(tǒng)的非競(jìng)爭(zhēng)性濁度模式進(jìn)行檢測(cè)，多糖體積為21μL，間隔A（血清）體積為21μL，間隔B體積為0，反應(yīng)緩沖液300μL，增益系數(shù)為4，反應(yīng)時(shí)間為3.5 min，反應(yīng)杯溫度為37℃。

1.4候選參考品血清工作濃度和線性范圍的確定12種兔源血清候選參考品用IMMAGE DIL1進(jìn)行0（原倍）、2、3、4倍稀釋，相應(yīng)型別肺炎球菌多糖均用IMMAGE DIL1稀釋至0.5、1、2、3、4、6、8、10和20μg／mL，采用非競(jìng)爭(zhēng)性濁度模式下的Rate Mode模式進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定2次。以多糖濃度為x，響應(yīng)值為y建立線性回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2），確定血清工作濃度和線性范圍。

1.5候選參考品檢測(cè)限及定量限的確定 以IMMAGE DIL1作為空白對(duì)照溶液，采用1.3項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)10次，計(jì)算反應(yīng)值的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），確定檢測(cè)限及定量限。

1.6候選參考品專屬性的檢測(cè) 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎球菌多糖根據(jù)血清型別配制相應(yīng)的陰性對(duì)照，即除相應(yīng)的型別外，將其他22種多糖用IMMAGE DIL1混合，配制成濃度為4.0μg／（mL·型）的多糖混合液；以1.0μg／mL相應(yīng)型別多糖作為陽(yáng)性對(duì)照。取陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，采用工作稀釋濃度的候選參考品，按1.3項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.7候選參考品穩(wěn)定性的檢測(cè) 將12型血清候選參考品按1.4項(xiàng)方法稀釋后，于2~8℃放置0和28 d；相應(yīng)型別的多糖用IMMAGE DIL1稀釋為1、2、3和4μg／mL。按1.3項(xiàng)方法檢測(cè)，并計(jì)算血清候選參考品放置28 d后的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.8與市售血清檢測(cè)結(jié)果比較 采用候選參考品（血清1）和市售丹麥血清（血清2）與對(duì)應(yīng)型別的肺炎球菌多糖（1、2、3和4μg／mL）確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定分別由廠家1和廠家2提供的各3批23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗，并計(jì)算RSD。

2 結(jié)果

2.1候選參考品的工作濃度和多糖線性范圍 根據(jù)候選參考品原倍及2、3和4倍稀釋液與多糖的反應(yīng)值，確定了各型候選參考品工作濃度（稀釋倍數(shù)）；各型候選參考品在相應(yīng)工作濃度下，多糖濃度在1~6μg／mL范圍時(shí)，與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均>0.980。見表1。

表1 候選參考品的工作濃度和線性范圍Tab.1 Workingdilutionsand linear rangesof candidatereferences

2.2候選參考品的檢測(cè)限及定量限 各型候選參考品檢測(cè)限為0.673~5.370，定量限為2.24~17.90，見表2。兩者均低于多糖候選參考品最低點(diǎn)（1μg／mL）時(shí)的反應(yīng)值，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)高于定量限。

表2 檢測(cè)限及定量限檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Determination of limits of detection and quantitation

2.3候選參考品的專屬性 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特異性血清候選參考品的陰性對(duì)照檢測(cè)值分別為1.723、2.087、1.464、0.923、1.257、0.908、1.707、1.511、0.762、0.837、1.357、1.232，均低于定量限；陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)值分別為18.87、27.86、11.83、15.04、9.70、10.64、7.42、8.94、15.77、6.90、13.14、9.96。表明候選參考品與其他型別的多糖抗原無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.4候選參考品的穩(wěn)定性 12種候選參考品于2~8℃放置28 d后與放置0 d時(shí)比較，反應(yīng)值的RSD均<10%，見表3。表明候選參考品于2~8℃放置28 d的穩(wěn)定性良好。

表3 候選參考品穩(wěn)定性的檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Stability test results of candidate references

2.5與市售血清檢測(cè)結(jié)果比較 血清1和血清2對(duì)廠家2生產(chǎn)的3批23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗（批號(hào)：S003762、S004498和S004574）中6B和9V型多糖檢測(cè)結(jié)果的RSD均>15%，對(duì)廠家2疫苗中其他型別及廠家1疫苗（批號(hào)：20190411、20190412和20190413）所有型別多糖檢測(cè)結(jié)果的RSD均<15%，見表4。

表4 2種血清檢測(cè)不同廠家23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗中各型多糖含量的結(jié)果Tab.4 Determination results of polysaccharide contents of various serotypes in 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccines from various manufacturers by prepared national references and commercial serum

3 討論

1983年，23價(jià)肺炎球菌莢膜多糖疫苗在美國(guó)獲批上市［11］；2000年，7價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗在美國(guó)獲批上市［12］；2010年，13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗替代7價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗上市［13］。肺炎球菌多糖作為肺炎球菌多糖疫苗的主要活性成分，各型多糖含量的測(cè)定是該疫苗效力試驗(yàn)的替代指標(biāo)，是確保該疫苗質(zhì)量有效穩(wěn)定的重要質(zhì)控指標(biāo)之一。1983年，LEE［14］建立了用于檢測(cè)23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗中的各型多糖含量的光散射定量比濁法。本課題組前期將該方法轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行了相關(guān)的方法學(xué)驗(yàn)證，在肺炎球菌多糖國(guó)家參考品的研制中，采用該方法進(jìn)行了多糖定量的協(xié)作標(biāo)定，建立了肺炎球菌多糖國(guó)家參考品［15］。目前，全球僅有丹麥血清研究所提供肺炎球菌型特異性血清，但價(jià)格昂貴、貨期長(zhǎng)，且不同批號(hào)之間抗體含量不穩(wěn)定，因此，亟需制備穩(wěn)定、無(wú)交叉反應(yīng)的肺炎球菌特異性血清國(guó)家參考品，用于速率比濁法檢測(cè)各型多糖含量。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫化學(xué)系統(tǒng)（IMMAGE 800），選擇特定參數(shù)，12種血清候選參考品的工作濃度在原倍至4倍稀釋之間，對(duì)應(yīng)型多糖濃度在1~6μg／mL檢測(cè)范圍內(nèi)，與反應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系（R2＞0.980）；各型血清候選參考品檢測(cè)限和定量限均低于多糖參考品最低點(diǎn)（1μg／mL）；專屬性檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照均低于定量限，表明12種特異性血清候選參考品特異性好，無(wú)交叉反應(yīng)；工作濃度血清于2~8℃保存28 d仍具有良好的穩(wěn)定性；市售血清及本實(shí)驗(yàn)制備的血清國(guó)家參考品對(duì)廠家2生產(chǎn)的3批制品中6B和9V型檢測(cè)結(jié)果的RSD>15%，可能是由于6B和9V均是因子血清，比型特異性血清抗原位點(diǎn)少，多糖來(lái)源不同，導(dǎo)致結(jié)果有較大差異；對(duì)廠家2其他型別及廠家1所有型別檢測(cè)結(jié)果的RSD均<15%。對(duì)于廠家2生產(chǎn)的23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗，6B型和9V型血清結(jié)果需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)制備的1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特異性血清國(guó)家參考品具有良好的特異性和穩(wěn)定性，可用于速率比濁法檢測(cè)肺炎球菌多糖疫苗和多糖結(jié)合疫苗中的多糖含量。