付欣，張玉蒼，李瑞松，劉群，郭佳益

（1 海南大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南 ?？?570228；2 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021）

原花青素（proanthocyanidins，PC）是一種由類黃酮單元組成的多酚聚合物，作為天然的抗氧化劑，具有優(yōu)異的清除自由基能力。此外，Rocha等發(fā)現(xiàn)PC 能有效抑制α?葡萄糖苷酶和醛糖還原酶，顯示出PC 調(diào)節(jié)Ⅱ型糖尿病能力；Grau?Bové等和Nallathambi 等研究發(fā)現(xiàn)PC 可以減輕代謝綜合征的癥狀，從而調(diào)節(jié)腸道生物菌群。但PC 極易受酸堿度、溫度、胃腸環(huán)境等因素的影響而降解，由此破壞PC 的結(jié)構(gòu)，影響PC 的生物利用度。因此，開發(fā)一種具有保護(hù)天然產(chǎn)物功能的載體是解決天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)易被破壞、生物利用度低的有效途徑之一。

近年來，納米脂質(zhì)體、納米膠束、納米凝膠、納米囊泡及無機(jī)納米顆粒等被廣泛應(yīng)用于納米載藥體系。相比而言，納米介孔硅材料具有高比表面積、大孔容及孔徑均勻等結(jié)構(gòu)特性，以及良好的生物相容性和穩(wěn)定性，被認(rèn)為是最安全的無機(jī)材料之一。大量實(shí)驗(yàn)表明，納米介孔二氧化硅在生物活性物質(zhì)的緩釋和靶向釋放方面顯示出良好的應(yīng)用前景。

目前，二氧化硅納米顆粒常采用溶膠?凝膠法進(jìn)行合成，通常將硅源在不同催化劑條件下水解，縮合形成凝膠，老化、干燥去除溶劑。然而，溶膠?凝膠法合成的介孔硅材料極易團(tuán)聚且比表面積有限。相比而言，氣溶膠輔助技術(shù)由噴霧干燥技術(shù)衍生而來，是將液體霧化形成氣溶膠并快速干燥成粉末狀產(chǎn)品的一種簡單、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法。氣溶膠法在納米粒子合成中已展現(xiàn)出特有的優(yōu)勢：①反應(yīng)是一個連續(xù)快速的過程（氣溶膠技術(shù)輔助材料形成只需要幾秒鐘）；②可以通過調(diào)節(jié)前體溶液的種類與配比來控制材料的比表面積大小及孔徑分布；③均勻分散，分子均勻分布在前體溶液中，氣溶膠經(jīng)高溫迅速固化轉(zhuǎn)變?yōu)榉勰?，不存在水溶液中材料聚集生長產(chǎn)生團(tuán)聚的現(xiàn)象。為此，Ding等采用氣溶膠輔助法在陶瓷和玻璃基底上制備了目標(biāo)材料，減少了鍵斷裂步驟的需要，并促進(jìn)了材料生長過程中的前體分解過程；Maruoka 等利用氣溶膠法制備了氧化鋁催化劑載體來增強(qiáng)催化劑性能；Chai等使用氣溶膠法合成了分級氧化鎂微球，對重金屬離子具有較高的吸附能力和較強(qiáng)的抗菌活性；Park等運(yùn)用氣溶膠輔助合成了具有高硫負(fù)載率和高電導(dǎo)率的多孔空心碳納米管復(fù)合微球作為鋰?硫電池主體材料。因而，氣溶膠法廣泛運(yùn)用于納米粒子的合成。

基于以上分析，本研究利用氣溶膠法輔助自組裝形成中空結(jié)構(gòu)的介孔二氧化硅納米粒子，優(yōu)化不同硅源比例獲得具有極大比表面積的材料，并作為原花青素的載體。進(jìn)一步地，詳細(xì)研究了前體溶液霧化成氣溶膠并自組裝形成介孔二氧化硅過程的機(jī)理，為其制備及其運(yùn)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

硅酸四乙酯（TEOS，99%）、甲基三乙氧基硅烷（MTES，99%）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，99%）、氯化鈉（分析純）、香草醛（分析純）、原花青素（PC，分析標(biāo)準(zhǔn)品UV>95%），阿拉丁試劑公司；鹽酸（分析純）、硫酸（分析純），無水乙醇（分析純）、無水甲醇（分析純），西隴化工公司。實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水，電阻率為18MΩ·cm。單溫區(qū)管式高溫?zé)Y(jié)爐OTF?1200X，合肥科晶材料技術(shù)有限公司；液體氣溶膠發(fā)生器HRH?WAG3，北京慧榮和科技有限公司；單層板過濾器SHXB?DC?150，上海信步科技有限公司。

1.2 樣品表征

場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），Su8020 型，日本日立公司；場發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM），F(xiàn)EI Tecnai G2 F30型，美國FEI Com.；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），Nicolet IS10型，美國尼高公司；激光粒度儀（DLS），Zetasizer Nano ZS90，美國賽默飛公司；X 射線粉末衍射儀（XRD），BEUCKER D8 ADVANCE，德國布魯克公司；物理吸附儀（BET），ASAP 2460，美國麥克公司；熱重分析儀（TG），NETZSCH STA 449 F5/F3 Jupiter，德國耐馳公司；紫外分光光度計，MAPADA UV?3300PC，上海美普達(dá)公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 USPS與MSNs的制備

燒杯中按一定的摩爾比加入TEOS 與MTES 作為硅源，依次加入HCl（1mol/L，1.2mL）、無水乙醇（23mL）和超純水（57mL），充分?jǐn)嚢瑁S后添加4g CTAB和1g NaCl，在52kHz下超聲10min至透明混勻。一部分冷凍干燥得到前體固體粉末（USPS），另一部分以氮?dú)鉃檩d氣經(jīng)氣溶膠發(fā)生器霧化成氣溶膠，400℃退火處理，單層板框過濾器收集產(chǎn)物二氧化硅樣品（MSNs）。其中，4 種樣品制備的硅源配比如表1所示。

表1 樣品的硅源配比及孔結(jié)構(gòu)分析

1.3.2 HMSNs的制備

將1.3.1節(jié)中制備的MSNs于管式爐中氮?dú)獗Ｗo(hù)400℃煅燒5h 以除去模板劑，超純水洗滌，轉(zhuǎn)速10000r/min，離心15min，重復(fù)兩次，所得固體粉末于60℃烘干，得到中空介孔二氧化硅樣品（HMSNs）。

1.3.3 PC@HMSNs的制備

采用循環(huán)變溫浸漬法，將20mL 原花青素溶液置于裝有100mg吸附劑的試管中，30℃下在搖床內(nèi)吸附0.5h，然后4℃吸附0.5h，此為一組變溫浸漬，重復(fù)兩次。在轉(zhuǎn)速9000r/min條件下離心10min，所得固體于60℃烘干，并命名為PC@HMSNs（原花青素?介孔二氧化硅復(fù)合顆粒）。

1.4 負(fù)載性能的測定

取1.3.3節(jié)中離心后的上層清液，利用硫酸?香草醛比色法測定上清液中PC 的濃度。根據(jù)負(fù)載PC 前后溶液的吸光度值，按式(1)和式(2)計算出HMSNs 的負(fù)載率（%）以及HMSNs 的負(fù)載量（mg/g）。

式中，、分別為負(fù)載前后PC 溶液的吸光度；為未添加HMSNs 時PC 溶液的濃度，mg/mL；為負(fù)載時加入PC 溶液的體積，L；為負(fù)載時加入HMSNs的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 HMSNs形成機(jī)理分析

二氧化硅材料在納米藥物載體中已得到廣泛應(yīng)用，目前主流的合成方法有軟模板法、硬模板法、改進(jìn)的St?ber 法、氣凝膠法和快速自組裝法。本實(shí)驗(yàn)采用氣溶膠輔助自組裝法制備二氧化硅納米材料，合成過程如下。

2.1.1 水解?縮合過程

首先硅源水解成具有一定聚合度活性的Si(OH)中間體，由于活性中間體表面存在大量的硅羥基，通過橋氧交聯(lián)形成聚合物。根據(jù)DLVO 理論，鹽離子濃度增加壓縮了雙電子層，分子劇烈碰撞造成活性中間體聚集在一起，發(fā)生縮合反應(yīng)。Sakka等研究了鹽酸催化條件下正硅酸乙酯水解?縮合反應(yīng)生成膠態(tài)聚合物的機(jī)制：溶劑過少時，產(chǎn)物形成鏈狀線型聚合物；溶劑過多時，產(chǎn)物形成球形網(wǎng)絡(luò)狀膠態(tài)聚合物。

2.1.2 氣溶膠自組裝過程

CTAB溶于乙醇/水混合液作為前體溶液USPS，此時USPS 中表面活性劑CTAB 的濃度遠(yuǎn)低于臨界膠束濃度（CMC）。當(dāng)溶劑揮發(fā)誘導(dǎo)自組裝（EISA）過程發(fā)生，液滴中的CTAB 迅速形成一個徑向濃度梯度，且液滴外表面CTAB濃度最大。霧化作用下，乙醇優(yōu)先蒸發(fā)，非揮發(fā)性物質(zhì)濃度逐漸增加。液滴外表面CTAB濃度超出臨界膠束濃度。

霧化蒸發(fā)改變CTAB濃度的同時，無機(jī)物種和CTAB 之間產(chǎn)生Si—OH、Br、N(CH)(CH)的靜電相互作用。無機(jī)物種向液滴中心擴(kuò)散，形成二氧化硅?表面活性劑膠束，誘導(dǎo)無機(jī)物種進(jìn)行連續(xù)自組裝。有研究表明，NaCl由凝膠劑逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟０鍎┙橘|(zhì)，CTAB 用于支撐二氧化硅多孔網(wǎng)絡(luò)。液滴蒸發(fā)，溶質(zhì)濃度將達(dá)到過飽和狀態(tài)并開始成核，多孔網(wǎng)絡(luò)逐漸形成。由于鹽基質(zhì)沉淀后不能遷移，納米結(jié)構(gòu)二氧化硅被固定在鹽基質(zhì)中。

2.1.3 形貌分析

圖1 為USPS、MSNs 以 及HMSNs 的 掃 描 電 鏡圖。圖1(a)中USPS 顯示出片層結(jié)構(gòu)相互疊加的形貌，歸因于前體溶液中CTAB 形成了層狀中間相。圖1(b)中MSNs 顯示大小不一的不規(guī)則球狀，與水解?縮合過程中形成球形聚合物對應(yīng)。圖1(c)中HMSNs 顯示規(guī)則的球狀，顆粒尺寸約為500nm。證明經(jīng)過煅燒、水洗過程，二氧化硅網(wǎng)絡(luò)骨架保存良好，沒有出現(xiàn)結(jié)構(gòu)坍塌的情況。

圖1 形成過程的SEM圖

圖2(a)、(b)分別為MSNs、HMSNs 的TEM 圖，可以看出樣品均顯示球型顆粒，HMSNs 內(nèi)部存在空腔結(jié)構(gòu)，且表面分布介孔結(jié)構(gòu)。為了證實(shí)NaCl被除去，利用XRD 進(jìn)行分析，圖2(c)顯示出MSNs具有明顯的NaCl 特征衍射峰，對應(yīng)的衍射面分別為（111）、（200）、（220）、（311）、（222）、（400）、（420）和（422）晶面，與NaCl 標(biāo)準(zhǔn)卡片PDF#05?0628衍射峰出現(xiàn)的位置基本吻合。

圖2 MSNs、HMSNs的TEM、XRD圖

此外，在20°～25°之間有一個較弱寬峰，表明樣品中存在無定形二氧化硅。經(jīng)煅燒退火、水洗后，圖2(c)XRD 中NaCl 峰消失，顯示HMSNs 中的NaCl 完全去除，與圖2(b)HMSNs 的TEM 中空腔的出現(xiàn)吻合。圖2(d)中（100）晶面為介孔結(jié)構(gòu)的特征衍射面，與圖2(b)HMSNs的TEM表面介孔結(jié)構(gòu)相對應(yīng)，歸因于CTAB 在退火、水洗過程中除去，對此進(jìn)一步通過N吸附?脫附等溫線結(jié)果來確認(rèn)。

2.1.4 BET分析

圖3(a)為USPS、MSNs 以及HMSNs 的N吸附?脫附等溫線。其中USPS 和MSNs 在整個相對壓力區(qū)的吸附量均較??；HMSNs 的吸附等溫線在低壓區(qū)（/<0.1）緩慢上升，并在高壓區(qū)（0.9

H4 型回滯環(huán)的吸附支和脫附支平行，吸附量在高相對壓力區(qū)快速增加是由于吸附質(zhì)發(fā)生毛細(xì)管凝聚，發(fā)生吸脫附等溫線不重合現(xiàn)象，未達(dá)到吸附飽和度，這表明樣品中存在介孔結(jié)構(gòu)。圖3(b)為USPS、MSNs 以及HMSNs 的孔徑分布，可以看出HMSNs中主要分布有2～4nm的介孔，而MSNs中存在大孔結(jié)構(gòu)。

圖3 形成過程中N2吸附?脫附等溫線和孔徑分布圖

2.1.5 FTIR分析

圖4 展 示 了USPS、MSNs 和HMSNs 的 紅 外 譜圖。如圖所示，3440cm為Si—OH 伸縮振動，1630cm為水特征O—H 的彎曲振動峰，峰強(qiáng)度的降低源于硅羥基縮合反應(yīng)。2979cm為—CH不對稱伸縮振動，2920cm為—CH—不對稱伸縮振動峰，2850cm為—CH—對稱伸縮振動峰，它們均為CTAB 的—C—H 鍵特征振動峰。1470cm為CTAB 中C—N 的彎曲振動。以上CTAB 特征吸收峰強(qiáng)度逐漸降低直至消失，說明HMSNs中CTAB被除去。1277cm為Si—CH的振動特征吸收峰，此峰強(qiáng)度逐漸增加，表明甲基在形成樣品后成功接枝到樣品表面。USPS中1060cm、1143cm處乙醇的C—O 伸縮振動峰逐漸消失，對應(yīng)于自組裝時乙醇優(yōu)先蒸發(fā)過程。

圖4 形成過程的FTIR圖

2.2 HMSNs表征分析

2.2.1 TEM分析

圖5 為負(fù)載PC 前后HMSNs 的透射電鏡圖，圖5(a)中空腔被PC充填，PC經(jīng)介孔進(jìn)入MSNs內(nèi)部轉(zhuǎn)化為圖5(b)中的PC?HMSNs。歸因于HMSNs結(jié)構(gòu)中有大量的硅羥基，通過氫鍵使PC 結(jié)合到納米粒子的內(nèi)部，或通過一定的靜電作用與范德華力作用結(jié)合。

圖5 HMSNs、PC@HMSNs的TEM圖

2.2.2 FTIR分析

圖6 為采用不同硅源比制備的HMSNs 的紅外譜圖。如圖所示，1070cm處Si—O 伸縮振動峰、800cm處Si—O—Si 對稱伸縮振動峰和455cm處Si—O 彎曲振動峰強(qiáng)度基本不變，說明隨著TEOS/MTES摩爾比的降低，二氧化硅材料主體骨架的生成不會改變。1277cm處吸收峰為Si—CH特征振動吸收峰，2976cm處為—CH的特征振動吸收峰，隨著TEOS/MTES 摩爾比的降低，MTES 占比增加，特征峰強(qiáng)度逐漸增加，說明源于MTES的甲基逐漸增多。

圖6 不同HMSNs的FTIR圖

2.2.3 BET分析

圖7(a)為采用不同TEOS/MTES 摩爾比制備的HMSNs 的N吸附?脫附等溫線，圖中不同HMSNs均顯示出典型的Ⅵ型等溫線伴隨H4 型回滯環(huán)。結(jié)合圖7(b)的孔徑分布，表明HMSNs 均有分布在2～4nm之間的介孔結(jié)構(gòu)。同時，根據(jù)表1樣品的孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析，隨著TEOS/MTES 摩爾比降低，MTES 占比增加，樣品的比表面積先增大后減??；孔容積HMSNs?1 為0.32cm/g，其余孔容積均在0.37～0.40cm/g 之間波動；平均孔徑均都分布在2～4nm 之間。數(shù)據(jù)表明，樣品HMSNs?2 與HMSNs?3都具有大的比表面積和孔容積。最優(yōu)樣品的選擇通過進(jìn)一步分析粒徑與表面電位來判斷。

圖7 不同HMSNs的N2吸附?脫附等溫線和孔徑分布圖

2.2.4 DLS和zeta電位分析

圖8(a)和(b)為HMSNs?2樣品的粒徑和zeta電位分布圖，HMSNs?2的平均粒徑為548nm，與圖1(c)中SEM圖顯示出來的粒徑分布在500nm左右一致，且平均zeta 電位為?23mV。圖8(c)為不同HMSNs 樣品的平均粒徑與平均zeta 電位的變化圖，隨著TEOS/MTES 摩 爾 比 降 低，HMSNs、HMSNs?1 和HMSNs?2 的平均粒徑均在500nm，無明顯變化，表面電位絕對值略降低；HMSNs?3 的平均粒徑突增到1048nm，表面電位絕對值進(jìn)一步降低至13mV。

圖8 粒徑和zeta電位分布圖

表面電位絕對值較大時，粒子表面的高電荷密度使粒子間產(chǎn)生較大的靜電排斥力，從而使體系保持較高的穩(wěn)定性。當(dāng)Si—O基團(tuán)減少，S—CH基團(tuán)增多，使得表面電位絕對值降低，導(dǎo)致溶膠粒子易于團(tuán)聚，HMSNs?3 的平均粒徑驟然劇增。盡管HMSNs?3材料具有更大的孔容積，由于易團(tuán)聚，HMSNs?2材料的硅源制備比例60/40被選取為最優(yōu)比例并進(jìn)行形成過程機(jī)理研究。

2.1.6 負(fù)載性能分析

圖9 為不同HMSNs 對PC 吸附的負(fù)載率和負(fù)載量的變化圖，表明PC被成功負(fù)載進(jìn)入空腔結(jié)構(gòu)中。隨著TEOS/MTES 摩爾比降低，MTES 占比逐漸增大，負(fù)載率與負(fù)載量均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，可以看出其中PC@HMSNs?2 復(fù)合顆粒具有最大的負(fù)載率15.7%與負(fù)載量30.7mg/g，歸因于HMSNs?2材料具有最大的比表面積與相對較大的孔容積，PC可被最大限度地負(fù)載。

圖9 負(fù)載率和負(fù)載量變化圖

3 結(jié)論

（1）氣溶膠輔助自組裝的機(jī)理為水解?縮合和自組裝的協(xié)同作用?；钚灾虚g體在水解?縮合過程中形成二氧化硅網(wǎng)絡(luò)，與此同時，霧化后氣溶膠輔助法形成液滴，在徑向濃度梯度上自組裝成球狀。

（2）SEM、TEM 和FTIR 圖譜分析以及DLS 數(shù)據(jù)結(jié)果都表明合成的HMSNs 內(nèi)部具有較大的空腔且表面分布均勻的介孔。

（3）BET 模型顯示HMSNs 具有典型Ⅵ型吸附等溫線特征，高壓區(qū)的H4 型回滯環(huán)再次證明中空介孔結(jié)構(gòu)的形成。

（4）比較不同TEOS/MTES 摩爾比所制備的HMSNs樣品，HMSNs?2為最優(yōu)載體，有利于PC的負(fù)載，負(fù)載量能夠達(dá)到30.7mg/g。