張強，陳詩陽

（長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

隨著全球能源危機的不斷加劇，生物質(zhì)能源的研究引起了人們極大的興趣。利用地球上成本低廉、數(shù)量巨大的玉米秸稈等纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料酒精的研究備受關注。玉米秸稈主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，它們通過化學鍵連接成牢固的網(wǎng)狀結構，對相關的降解酶類具有較強的抗性，導致纖維素酶水解效率低下，因此秸稈酒精發(fā)酵首先要進行預處理。目前秸稈類物質(zhì)進行預處理的方法大致可分為物理法、化學法、物理化學法及生物法。作為氧化劑，氧在堿性條件下可被還原為氧離子自由基（·O）以及羥基自由基（·OH）等，這些衍生的活性基團對木質(zhì)素中常見的雙鍵、芳香環(huán)等基團有較強的反應性，能夠選擇性地氧化降解生物質(zhì)中的木質(zhì)素，并且?guī)缀醪挥绊懤w維素，因此在秸稈預處理過程中起著重要的作用。

本實驗是在丹麥瑞素國家實驗室所做的玉米秸稈濕熱預處理實驗基礎上進行的，195℃、15min被認為是玉米秸稈最佳濕熱預處理條件。本文在此基礎上，加入氧氣設置三種不同預處理條件，即條件1 （195℃，15min）、條件2 （195℃，15min，12bar O，1bar=0.1MPa）和條件3 （195℃，15min，12bar O，2g/L NaCO）對玉米秸稈進行預處理，對比氧氣輔助預處理后玉米秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量變化以及纖維素酶解葡萄糖收率，并對預處理后抑制劑對酒精發(fā)酵的影響進行研究，以期為纖維質(zhì)原料預處理及酒精發(fā)酵技術提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 玉米秸稈

玉米秸稈首先經(jīng)過氣流干燥，然后粉碎并篩分成1mm備用。

1.2 氧氣輔助濕熱預處理實驗

實驗采用丹麥瑞素國家實驗室2L 環(huán)型高壓容器進行。取60g處理好的玉米秸稈加入1L水，按照設置條件進行濕熱預處理實驗，然后將處理液過濾為固體濾餅及水解液兩部分。

1.3 原料玉米秸稈及預處理后固體濾餅組成分析

首先稱取0.16g 樣品，用1.5mL 72% HSO于30℃水解1h，然后加42mL 蒸餾水及標準樣品，121℃水解1h 過濾，糖的含量可由HPLC 測得，固體殘留物經(jīng)過干燥及稱重可計算出木質(zhì)素的含量。

1.4 預處理后水解液成分分析

濕熱預處理后所得的水解液用80g/L HSO在121℃下水解10min，糖的含量（葡萄糖及木糖等）可由HPLC測得。

1.5 纖維素酶解葡萄糖實驗

首先將預處理后干燥的原料粉碎，稱取110mg樣品加入0.2mol/L檸檬酸緩沖溶液（pH=4.8），加入纖維素酶（L）30FPU/DM（干重），50℃反應24h，水解后樣品于4000r/min離心10min。

纖維素酶解葡萄糖收率（ECC）計算如式(1)。

式中，為酶水解后的D?葡萄糖濃度，g/L；為總體積，L；為酶水解之前纖維素的質(zhì)量，g。

1.6 同步糖化發(fā)酵（SSF）實驗

預處理后的玉米秸稈固體部分與水解液的質(zhì)量比為8%（水解液預先用5mol/L NaOH 調(diào)整到pH 4.8）。首先在50℃進行24h預水解，加酶量10FPU/g（秸稈干重），然后再加入纖維素酶20FPU/g，同時加入0.2g 干酵母和0.2mL（24%）尿素，發(fā)酵在32℃進行。發(fā)酵完成后發(fā)酵液于3000r/min 離心處理10min，酒精濃度、糠醛及乙酸等抑制劑皆通過HPLC進行檢測，結果為三次實驗平均值。

1.7 液相色譜（HPLC）分析

色譜柱為Aminex HPX?87H （BIO?RAD），溫度63℃，流動相為4mmol/L HSO，流速0.6mL/min，檢測器為日本Shimadzu公司生產(chǎn)。

1.8 計算

纖維素及半纖維素的回收率計算如式(2)、式(3)。

2 結果和討論

2.1 不同加氧預處理條件對玉米秸稈組分的影響

采用上述三種條件對玉米秸稈進行預處理，預處理后分為固體濾餅與水解液兩部分。纖維素主要存在于固體濾餅中，而半纖維素主要存在于水解液中，化學組成發(fā)生了明顯變化。從表1 和圖1 可見，與原料玉米秸稈相比，玉米秸稈經(jīng)過三種條件預處理后，固體濾餅中主要為纖維素，而半纖維素含量明顯減少。固體濾餅中纖維素質(zhì)量分數(shù)分別為55.9%、74.7%和73.3%，半纖維素質(zhì)量分數(shù)分別為9.5%、7.1%和4.9%，而木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)分別為25.2%、17.5%和13.7%。水解液中纖維素含量較低，半纖維素含量較高。經(jīng)計算，預處理后纖維素總體收率分別為91.2%、94.6%和95.9%，而半纖維素總體收率分別為74.5%、50.3%和68.2%。從以上數(shù)據(jù)分析中可知，3種預處理條件下，纖維素收率都比較高，平均在90%以上，而且纖維素絕大部分都保留在固體中，表明加氧預處理對纖維素收率影響不大。但是預處理過程中堿液NaCO能夠削弱纖維素和半纖維素之間的氫鍵及皂化半纖維素和木質(zhì)素分子之間的酯鍵，對纖維素起緩沖保護作用形成堿化纖維素，導致纖維素溶脹不易被破壞。另外與使用強堿性物質(zhì)NaOH 等相比，NaCO能夠減少對環(huán)境和設備傷害和腐蝕，也能改善微生物發(fā)酵效果，因此經(jīng)過條件3預處理獲得了更高的纖維素收率。而半纖維素收率變化較大，主要由于大部分半纖維素發(fā)生了溶解或降解，O的加入促進了半纖維素的溶出，所以經(jīng)過預處理條件2 和條件3 后半纖維素無論從固體濾餅中的含量還是從總收率來看都低于條件1。

表1 預處理后玉米秸稈化學組成（質(zhì)量分數(shù)）單位：%

圖1 不同預處理條件下固體濾餅中各部分組成

木質(zhì)素是由苯丙素類單體構成的無定形態(tài)高聚物，結構中包含大量苯環(huán)、雙鍵等不飽和結構。在條件1濕熱預處理過程中，半纖維素發(fā)生脫乙酰基反應，形成乙酸等酸性物，導致半纖維素的酸性降解和水解。由于弱酸處理不能有效脫除木質(zhì)素，因而濕熱預處理后玉米秸稈的木質(zhì)素相對含量較高，木質(zhì)素殘留量達到25.2%。氧在反應過程中產(chǎn)生的氧離子自由基（·O）以及羥基自由基（·OH）等能夠對木質(zhì)素中的雙鍵、芳香環(huán)等基團有較強的反應性，從而造成木質(zhì)素和木聚糖的共價連接被破壞而成為水溶性成分，而且較高的氧氣壓力更有效，能夠明顯提高木質(zhì)素的分解速率，所以經(jīng)過有氧預處理能夠明顯降低木質(zhì)素含量。加入堿性物質(zhì)NaCO能使木質(zhì)素中的酚羥基和烯醇基變?yōu)楦谢钚缘姆欲}和烯酮鹽，能夠加快氧的反應速度，促進木質(zhì)素降解，因此采用預處理條件3后木質(zhì)素最低含量降為13.7%，可見氧氣和堿協(xié)同作用更有利于木質(zhì)素的去除。

2.2 葡萄糖收率

采用葡萄糖收率來評估玉米秸稈預處理的效果。葡萄糖主要來自于玉米秸稈預處理后固體濾餅中纖維素的酶解，另外預處理過程中纖維素降解也會產(chǎn)生少量的葡萄糖。纖維素酶水解纖維素生成葡萄糖是生產(chǎn)酒精的關鍵。從圖2 可以看出，經(jīng)過條件3 處理后的葡萄糖總收率達到73.5%，高于經(jīng)條件1 和條件2 處理的69.4%和72.1%。其中三種處理條件下的葡萄糖酶解率分別為64.8%、65.8%和67.6%，遠高于未經(jīng)預處理的原料玉米秸稈的16.2%?？梢婎A處理破壞了玉米秸稈的致密結構，提高了纖維素酶的酶解效率，從而獲得了較高的葡萄糖收率。在木質(zhì)纖維素原料中，纖維素降解性能與木質(zhì)素含量密切相關，纖維素降解性能越好，原料中木質(zhì)素含量越低，主要由于木質(zhì)素可以吸附部分纖維素以及對纖維素酶具有一定的物理屏障作用。因此木質(zhì)素被認為是影響纖維素酶水解的主要障礙，消除或減弱木質(zhì)素的阻礙作用是提高纖維素水解效率的關鍵，因此經(jīng)過條件3處理后獲得了最高的葡萄糖收率。

圖2 不同預處理條件下葡萄糖收率

2.3 抑制劑對酒精發(fā)酵的影響

玉米秸稈在濕熱預處理過程中主要產(chǎn)生了兩類抑制劑：一類是以糠醛為代表的醛類抑制劑，主要由己糖和戊糖在酸性環(huán)境下脫水生成；另一類是以乙酸為代表的羧酸類抑制劑，乙酸由半纖維素脫乙酰生成。本研究主要測定了三種預處理條件下水解液中糠醛和乙酸的含量，見表2。從表2 中可以看出，由于O的加入促進了半纖維素的溶出，半纖維素發(fā)生脫乙酰基反應會形成乙酸等酸性物質(zhì)，所以采用加氧預處理后乙酸的含量會有較為明顯的升高。從圖3可知，隨著發(fā)酵進行，乙酸濃度緩慢增加，主要因為所使用的釀酒酵母中含有少量乳酸菌，代謝部分木糖會產(chǎn)生少量乙酸，通過酸化作用使細胞生長受到抑制。通常乙酸濃度達到2g/L可引起菌體數(shù)量下降，達到4g/L 可引起酒精產(chǎn)量下降，但較低的濃度則不會對發(fā)酵產(chǎn)生明顯的影響。糠醛主要由己糖和戊糖在酸性環(huán)境下脫水生成，所以采用加氧預處理后酸性條件下糠醛的含量也會有較為明顯的增加。醛類化合物主要會抑制酵母生長，使發(fā)酵過程出現(xiàn)遲滯期?？啡舛纫话氵_到1g/L 會對酵母產(chǎn)生抑制作用，另外酵母菌也能夠代謝或降解部分糠醛等物質(zhì)，利用遲滯期進行脫毒作用，所以從圖3中看到，隨著發(fā)酵進行，糠醛濃度會逐漸降低。

圖3 發(fā)酵過程中抑制劑濃度的變化

表2 水解液中主要抑制劑的組成

采用釀酒酵母對濕熱處理后的玉米秸稈固體與水解液混合液（底物濃度為質(zhì)量分數(shù)8%）進行同步糖化發(fā)酵（SSF）實驗，同時以原料玉米秸稈作為對照，結果如圖4。從圖4 可知，142h 發(fā)酵，經(jīng)過條件3處理的玉米秸稈酒精產(chǎn)量達到25.0g/L，高于條件1和條件2下的17.2g/L和24.3g/L，而原料玉米秸稈酒精濃度僅為4.2g/L。另外從圖4 也可以看到，經(jīng)過加氧預處理的玉米秸稈發(fā)酵液在4h 左右會出現(xiàn)由于醛類物質(zhì)作用短暫出現(xiàn)的遲滯期，由于發(fā)酵液中糠醛濃度均較低，所以抑制作用并不明顯，隨后酒精濃度迅速增加，經(jīng)過條件3處理的玉米秸稈酒精發(fā)酵液最終獲得了25.0g/L 的最高酒精產(chǎn)量。

圖4 發(fā)酵過程中酒精濃度變化

3 結論

采用三種不同氧氣輔助濕熱預處理條件處理玉米秸稈：條件1（195℃，15min），條件2（195℃，15min，12bar O），條件3（195℃，15min，12bar O，2g/L NaCO）。實驗結果表明：經(jīng)過條件3 處理的玉米秸稈纖維素收率和葡萄糖收率最高，分別為95.9%和73.5%，并且利用釀酒酵母，在底物濃度為質(zhì)量分數(shù)8%時，經(jīng)過142h發(fā)酵，獲得最高酒精濃度25.0g/L，發(fā)酵過程沒有明顯的抑制作用發(fā)生。以上實驗結果表明，氧氣輔助濕熱預處理玉米秸稈過程中，氧氣主要與木質(zhì)素發(fā)生反應，降低了木質(zhì)素含量，尤其與堿性物質(zhì)碳酸鈉（NaCO）結合，有效提高了纖維素收率和纖維素酶解效率，最終獲得了較高的酒精收率，而且發(fā)酵過程中沒有明顯的抑制作用發(fā)生。