付瑞明，胡金春，孟兆青，李強，曹桂云，王岱杰，閆慧嬌*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省分析測試中心 山東省大型精密儀器分析應用技術(shù)重點實驗室， 山東 濟南 250014；2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250000)

標準樣品作為均勻的、確定了特性值的材料或物質(zhì)[1]，在儀器校準、分析檢測和質(zhì)量控制中必不可少。隨著中醫(yī)藥的國際化，其生產(chǎn)及科研工作中都急需與ISO對接的標準樣品，而我國研發(fā)的中藥標準樣品難以滿足相關(guān)行業(yè)的發(fā)展需要[2]，研制具備量值傳遞功能且可溯源的有證國家標準樣品具有重要的現(xiàn)實意義。

銀杏是原產(chǎn)于我國的重要經(jīng)濟樹種，銀杏葉已收錄于《中國藥典》2015年版一部[3]，是出口創(chuàng)匯的重要中藥品種，富含大量的次生代謝產(chǎn)物，其中最具藥用活性的成分是銀杏類黃酮與萜內(nèi)酯[4]。銀杏葉提取物已經(jīng)成為制藥、保健品和化妝品行業(yè)最受歡迎的成分之一，銀杏葉制劑在國內(nèi)外市場供不應求，年銷售總額達100億美元，是全球領先的植物藥品種[5]。

白果內(nèi)酯(bilobalide)是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物[6-9](圖1)，是銀杏葉中的主要活性成分，也是控制銀杏葉藥材質(zhì)量和成藥標準的重要指標[10-12]。白果內(nèi)酯是用于治療神經(jīng)、腦和脊髓等相關(guān)疾病的藥物[13-15]，對銀杏葉制劑的療效和產(chǎn)品質(zhì)量控制起著關(guān)鍵的作用。目前市場上白果內(nèi)酯純品主要為對照品，尚缺乏具備溯源性的國家標準樣品。因此，本研究建立了銀杏葉中分離純化白果內(nèi)酯的方法，根據(jù)GB/T15000.3—2008/ISO Guide 35:2006[16]研制了白果內(nèi)酯國家標準樣品，為銀杏葉藥材及相關(guān)制劑等產(chǎn)品的分析檢測及質(zhì)量控制提供實物標準支撐。

圖1 白果內(nèi)酯的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of bilobalide

1 材料

1.1 藥材與試劑

銀杏葉(銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉)(濟南建聯(lián)中藥店)；色譜純甲醇、乙腈(山東禹王試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)，600 MHz核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司)，6520 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司)，10N冷凍干燥儀(寧波新芝有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 白果內(nèi)酯單體的制備

圖2 白果內(nèi)酯的制備液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of bilobalide purified using preparative LC

2.2 純度分析

分別采用高效液相色譜(high performance liguid chromatography,HPLC)、薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、熱重(thermogravimetric,TG)分析技術(shù)進行樣品純度分析。

2.2.1 HPLC法

圖3 白果內(nèi)酯的等度洗脫HPLC圖譜Fig.3 HPLC Chromatogram of bilobalide by equivalent elution

圖4 白果內(nèi)酯的梯度洗脫HPLC圖譜Fig.4 HPLC Chromatogram of bilobalide by gradient elution

2.2.2 TLC法

2.2.3 LC-MS法

色譜柱Navo-micro C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水，梯度洗脫0～30 min，10%～100%A；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；時間30 min。MS條件：電噴霧離子源ESI，毛細管電壓4.0 kV，載氣普氮流速10 L/min，溫度300 ℃，掃描范圍為m/z=100～1000。從樣品總離子流圖(圖5～6)中未發(fā)現(xiàn)明顯雜質(zhì)峰存在。

圖5 白果內(nèi)酯正離子模式下總離子流圖Fig.5 Chromatogram of the total ion flow of bilobalide in the cation mode

圖6 白果內(nèi)酯負離子模式下總離子流圖Fig.6 Chromatogram of the total ion flow of bilobalide in the anion mode

2.2.4 TG分析

初溫30 ℃，以10 ℃/min的速率升溫，至最終溫度600 ℃，氣體N2；流量 100 mL/min。從TG分析圖譜(圖7)可以看出，TG曲線在28.1～280.9 ℃范圍內(nèi)為水平線，該溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，316.7 ℃之后開始分解。多種方式的聯(lián)合檢驗可判斷出樣品純度高，雜質(zhì)含量較少。

圖7 白果內(nèi)酯的TG曲線Fig.7 The TG curve of bilobalide

2.3 結(jié)構(gòu)表征

表1 白果內(nèi)酯的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR data of bilobalide

表2 白果內(nèi)酯的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Table 2 13C-NMR data of bilobalide

續(xù)表2

2.4 均勻性檢驗

依據(jù)GB/T 15000.3—2008 第7章工作導則[16]要求，均勻性檢驗在相對獨立和潔凈空間進行分裝，隨機抽取10瓶，分別從每瓶中取樣至4 mL棕色瓶，每份樣品1.0 mg溶于1.0 mL色譜純的甲醇，HPLC分析，以峰面積計算樣品的純度值，樣品純度總平均值為99.86%。以F檢驗確定白果內(nèi)酯標準樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，分析樣品的瓶間均勻性和瓶內(nèi)均勻性(圖8)。

圖8 均勻性檢驗結(jié)果Fig. 8 Measurement data of the homogeneity test

從均勻性檢驗的方差分析(表3)可見，瓶間自由度為9，瓶內(nèi)自由度為20，經(jīng)查表得F0.05(9，20)=2.94，由于F=SM瓶間/SM瓶內(nèi)=1.25

表3 均勻性檢驗方差分析Table 3 Variance analysis of the homogeneity test

2.5 穩(wěn)定性檢驗

樣品分裝后于2～8 ℃保存。選擇兩年實驗周期，對制備的白果內(nèi)酯標準品取樣進行HPLC分析，每份樣品重復測定5次，統(tǒng)計分析采用t檢驗法[16]。隨著時間的延長，24個月內(nèi)檢測值未見顯著升高或降低，以直線為經(jīng)驗模型觀察斜率值，預測穩(wěn)定性變化，結(jié)果顯示變化不顯著，未觀測到明顯的不穩(wěn)定性，即本樣品在兩年內(nèi)的長期穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見圖9。

圖9 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果Fig.9 Measurement data of the stability test

2.6 定值檢測

按照GB/T15000.3—2008標準要求，采用8個實驗室協(xié)作實驗定值，共隨機抽取24瓶樣品，平均寄送至8家實驗室，每份樣品重復檢測2次，通過峰面積歸一化法讀取純度[16, 19]。白果內(nèi)酯純度定值結(jié)果見圖10，樣品純度總平均值，即協(xié)作實驗室測定的白果內(nèi)酯標準值為99.88%。

圖10 協(xié)作定值數(shù)據(jù)Fig.10 Data of collaborative certification

標準樣品的定值結(jié)果為標準值99.88%，代入數(shù)據(jù)計算得白果內(nèi)酯標準樣品的最終不確定度為0.22%。

3 結(jié)論

本文建立了一種銀杏葉中白果內(nèi)酯單體的分離制備方法，具有制備成本低及效率高的特點，可以實現(xiàn)較大量地從銀杏葉中分離制備出高純度白果內(nèi)酯單體成分?；谠摷夹g(shù)并經(jīng)8家實驗室協(xié)作定值，成功研制出標準值為99.88%的白果內(nèi)酯國家標準樣品，95%置信區(qū)間的不確定度為0.22%，樣品均勻性符合國家標準，2～8 ℃條件下24個月內(nèi)的長期穩(wěn)定性良好，順利通過專家組驗收。該研究解決了白果內(nèi)酯及相關(guān)產(chǎn)品缺乏國家標準樣品的問題，為我國銀杏葉藥材及相關(guān)制品的生產(chǎn)質(zhì)量控制及分析檢測提供了物質(zhì)基礎。