孫秀枝，張 麗，賈代成，孟 琳，羅漢民，陳鳳龍，公丕峰*

（1.淄博市張店區(qū)農業(yè)技術服務中心，山東 淄博 255000；2.淄博市農業(yè)農村數(shù)字發(fā)展中心，山東 淄博 255000；3.淄博魯中農作物研究所，山東 淄博 255000）

高質量種子是農業(yè)高產的基礎，高質量種子應兼有優(yōu)良的品種屬性和良好的播種品質，其中播種品質是指種子的凈度、水分、飽滿度、發(fā)芽率、活力及健康度等[1]。目前市場上的農作物種子只對種子的凈度、水分、發(fā)芽率和純度4 項質量指標進行了規(guī)定，并以此來判斷種子質量的高低。隨著現(xiàn)代種業(yè)的發(fā)展，種子貿易日益頻繁，種子質量評價的標準和內容不再滿足于這4 項指標，種子健康度指標越來越受到重視，對種子健康度進行檢驗與控制勢在必行[2]。

1 研究背景

1.1 國外研究概況

植物病害委員會（ISTA）是一個為國際種子健康檢驗制定通用標準方法的組織，其宗旨是確保健康的種子可以在全球范圍內無障礙流通。目前，ISTA 共出版了64 本種傳病害檢驗工作手冊，其中14 種方法被納入ISTA 規(guī)則中。

1917 年，Hiltner 觀察到禾谷類種子，特別是燕麥種子的田間出苗率與實驗室中測得的發(fā)芽率相差甚遠，把這種現(xiàn)象歸因于感染了Fusarium ni-vale 的種子生長力太弱，只能在適宜的實驗室條件下發(fā)芽，而不能在田間出苗。

1928年，ISTA制定了第一部世界種子檢驗規(guī)程。種子檢疫部分詳細介紹了禾谷類作物中的Clavicep-spurpurea、Fusarium、Tilletia 和Ustilagohordei，豌豆中Ascochyta，菜豆中Colletotrichumlindemuthianum，亞麻中Botrytis、Colletotrichum linlcola 和Aureobasidumlini的檢驗。

1931 年，在ISTA 第六次代表大會上，ISTA 首任負責人L.C.Doyer 博士提出了“在國際種子檢驗規(guī)程中增加種子健康檢驗”的建議。隨后，1938 年，L.C.Doyer博士主編了《種傳病害檢驗手冊》，第一次提出了檢驗和確認種傳真菌、細菌、線蟲和昆蟲重復性較高的方法。

1993 年，ISTA 第一屆座談會在加拿大渥太華召開，主題是“種子健康檢驗中的質量保證”。第二屆座談會于1996 年在英國劍橋召開，主題是“種子健康檢驗——面向21 世紀的工程”，第三屆于1999 年在美國依阿華召開，主題是“病害脅迫與其在種子健康檢驗中的作用”。

種子健康檢驗的組織與技術體系歷經一個多世紀的發(fā)展，已成為世界種子貿易中質量控制的重要組成部分。

1.2 國內研究概況

我國對農作物種子健康度研究也經歷了一個漫長的過程。1981 年，原農業(yè)部舉辦種子病理檢疫講習班，邀請Paul Neergard 來華講學。1990 年，中國農業(yè)大學等高校設立本科生和研究生《種子病理學》課程。1993 年，中國農業(yè)大學設立種子科學系。1998 年12 月，在北京召開全國第一屆種子病理學術研討會，并成立中國植物病理學會（CSPP）種子病理學專業(yè)委員會（SPC），培訓內容為“種子苗木病害的控制與種子預防保健”。1999 年7 月，印度V.G.Agarwal 來中國進行學術交流，對“小麥散黑粉病的整胚檢驗法”進行探討。2001 年8 月，在昆明召開全國第二屆種子病理學術研討會，主題為“健康的種子 健康的生活”。2006 年8 月，在長沙召開全國第三屆種子病理學術研討會。1995 年國家技術監(jiān)督局發(fā)布的《農作物種子檢驗規(guī)程》（GB/T 3543.1—1995）中“其他項目檢驗”對種子健康度檢驗進行了簡單概述，但可操作性不強。

2 研究意義及目標

種子健康度檢測不僅為種子生產、調運提供切實可行的參考依據(jù)，還可指導農民科學用種，運用科學生態(tài)的病害防治方法全面提高種子質量，防止和控制種傳病害[3]。

2.1 意義

2.1.1 種子貿易發(fā)展的必然要求

隨著種子貿易國際化進程加快，種業(yè)市場競爭日益激烈，質量問題成為種子貿易的關鍵，常規(guī)的水分、凈度、純度和發(fā)芽率檢驗已不能滿足種子貿易的需求，對種子健康度檢測是非常有必要的。

2.1.2 為解決種子質量糾紛提供科學依據(jù)

近年來，因種子帶菌引起的種子質量糾紛時有發(fā)生，特別是播種后苗期缺苗斷壟現(xiàn)象，以及后期病害流行成災，造成這些現(xiàn)象的主要原因是發(fā)芽率和種子病原問題，嚴重影響了農業(yè)生產和社會穩(wěn)定。健康度檢測能為解決種子糾紛提供科學依據(jù)，保護消費者的合法權益。

2.1.3 防止種傳病害的需要

種傳病害對農業(yè)生產的危害表現(xiàn)在以下方面。一是種子攜帶的病原體可以在植株從發(fā)芽到收獲的任意階段引起田間病害，降低作物的商品價值。二是種傳病害可引起幼苗價值降低，引起發(fā)芽或田間出苗不良，產生不正常幼苗。三是病原可隨種子批流轉，種子帶菌是遠距離傳播病害的重要途徑。通過檢測種子所攜帶病蟲害種類及數(shù)量可以發(fā)現(xiàn)檢疫性傳染病害，確定種子批的使用價值，評定種子批是否需要經過種子處理，以及處理前后對發(fā)芽率的影響，提高種子質量[4]。

2.2 目標

2.2.1 跟蹤評價全市小麥種子健康狀況

通過研究，對淄博市不同區(qū)、縣的小麥種子生產基地種子帶菌情況進行跟蹤評價，指導種子企業(yè)合理布局種子生產基地，科學處理帶菌種子，有效阻止帶病、帶菌種子的傳播。

2.2.2 研究制定小麥種子健康度檢測技術操作規(guī)范

開展種子健康度檢測，規(guī)范種子健康度檢測方法，制定淄博市《小麥種子健康度檢測技術操作規(guī)范》，雖然《農作物種子檢驗規(guī)程》（GB/T 3543.1—1995）的“其他項目檢驗”對種子健康度檢驗進行了簡單概述，但在實際操作中多數(shù)檢測僅限于有害動物檢測，對病原菌體檢測較少。此項檢測方法將是對《農作物種子檢驗規(guī)程》中“其他項目檢驗”的有力補充。

2.2.3 研究制訂小麥病害高效防治措施

淄博市是重要的工業(yè)城市，環(huán)境污染問題突出。近年來，農藥引起的環(huán)境污染問題也日益顯現(xiàn)，通過配制應用高效種衣劑，實現(xiàn)從源頭上防治種源病害，減少農業(yè)生產中農藥的使用量，降低環(huán)境污染。

3 試驗過程及分析

3.1 抽取試驗材料

2013 年10 月從淄博市5 家種子企業(yè)10 個生產基地收集未經篩選的小麥種子樣品17 個，2014 年9月從淄博市5 家種子企業(yè)10 個生產基地收集經過篩選的小麥種子樣品18 個。試驗培養(yǎng)對象為作物種子表面附帶的真菌及內部寄藏的真菌。小麥種子外觀完整，沒有種皮破損的不完整粒。樣品符合取樣要求，并具有代表性。

3.2 制備PDA 培養(yǎng)基

先將馬鈴薯洗凈去皮，稱取100 g 馬鈴薯切成1 cm3的小塊，加水約500 mL，煮沸30 min，稱取葡萄糖10 g 放置在500 mL 燒杯中，用4 層紗布將馬鈴薯液過濾至廣口瓶中，稱取瓊脂15～20 g 放至500 mL 三角瓶中，將溶有葡萄糖的馬鈴薯液倒入三角瓶中，搖勻，再補足水分至500 mL，加塞、封口。高壓、121 ℃滅菌30 min 后取出，放置于超凈工作臺冷卻。將滅菌冷卻后的培養(yǎng)基倒入無菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基層厚度以3～5 mm 為宜，待冷卻凝固后備用。

3.3 菌種分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

3.3.1 菌種分離純化

在超凈工作臺上對未經篩選的17 份小麥種子樣品和經過篩選的18 份小麥種子樣品，分別用0.1%升汞進行表面消毒10 min，再用無菌水進行洗滌（設6 個小燒杯，倒入無菌水，將消毒處理的小麥種子進行稀釋洗滌，小麥種子在燒杯中滯留時間約10 s），用無菌濾紙吸干種子沾附的水分。將表面消毒處理后的小麥種子種胚處切去種皮，接種到培養(yǎng)基。每份樣品設置8 個重復，每個重復100 粒。將接種好的培養(yǎng)基放置在20℃、黑暗條件下的培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)7 d。

3.3.2 菌種形態(tài)學觀察

采用組織分離法，對17 份未經篩選的小麥種子樣品進行菌種的分離、純化，獲得3 種純化的菌種；對經過篩選的18 份小麥種子樣品進行菌種的分離、純化，獲得兩種純化的菌種。在28 ℃PDA 培養(yǎng)基條件下，用生物顯微鏡進行形態(tài)學觀察。利用形態(tài)特征分析法，對菌落特征特性進行觀察，與典型菌落特征進行比較，確定菌種類型為黃曲霉、黑粉菌和鐮刀菌。

3.4 小麥種子帶菌率測定

對收集的未經篩選的17 份小麥種子樣品和經過篩選的18 份小麥種子樣品，在無菌濾紙上進行培養(yǎng)，每個樣品設置4 個重復，每個重復100 粒，觀察篩選加工對小麥種子帶菌率的影響。

觀察發(fā)現(xiàn)，未經過篩選的小麥種子帶菌率遠遠大于經過篩選的小麥種子帶菌率。

3.5 菌種致病性測定

3.5.1 室內發(fā)芽試驗

將直徑0.6 cm 的菌餅置于28 ℃避光條件下，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。用2 塊直徑0.6 cm 不同菌種的菌餅分別與5 mL、10 mL、15 mL 和20 mL 無菌水配制不同接種量的菌液，分別用10 mL 不同接種量的菌絲懸浮液處理山農15 小麥種子5 min，然后將處理過的小麥種子放置于紙床上，在20 ℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7 d。設置一個空白對照處理，每個處理3 個重復，每個重復100 粒，從第四天開始，每天定時測定不同處理小麥種子的發(fā)病率。

1）黃曲霉處理。通過對不同濃度黃曲霉菌液處理下山農15 小麥種子發(fā)芽率的差異分析發(fā)現(xiàn)，用不同濃度黃曲霉菌液處理種子5 min 后，處理間的發(fā)芽率無顯著差異。

2）鐮刀菌處理。通過對不同濃度鐮刀菌菌液處理下山農15 小麥種子發(fā)芽率的差異分析發(fā)現(xiàn)，用不同濃度鐮刀菌菌液處理種子5 min 后，2 菌餅/5 mL 處理和2 菌餅/10 mL 處理與空白對照間的發(fā)芽率存在顯著差異。

3）黑粉菌處理。通過對不同濃度黑粉菌菌液處理下山農15 小麥種子發(fā)芽率的差異分析發(fā)現(xiàn)，用不同濃度黑粉菌菌液處理種子5 min 后，用2 菌餅/5 mL 濃度菌液處理過的種子，發(fā)病情況較其他處理無顯著差異，但幼苗長勢較弱，與對照相比存在差異。

3.5.2 田間試驗

將直徑0.6 cm 的菌餅置于28 ℃避光條件下，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。用2 塊直徑0.6 cm 的不同菌種的菌餅分別與5 mL、10 mL、15 mL 和20 mL 無菌水配制不同接種量的菌液，分別用10 mL 不同接種量的菌絲懸浮液處理山農15 小麥種子5 min，然后將處理過的小麥種子種植在魯中農作物研究所試驗田，設置1 個空白對照處理，每個處理3 個重復，每個重復用種量30 g，觀察不同菌種處理后田間發(fā)病情況。田間種植觀察中可以發(fā)現(xiàn)，接種濃度2 菌餅/5 mL 的不同菌種菌液，鐮刀菌的致病效果明顯，黑粉菌次之，黃曲霉與對照相比無差異。

3.5.3 確定致病性

在小麥生長期間，觀察幼苗、秸稈及穗部發(fā)病情況。對上述室內發(fā)芽試驗中出現(xiàn)的爛芽和田間的小麥病株進行采集取樣，并對發(fā)病部位進行菌種分離純化，根據(jù)柯赫氏法則確定獲得菌種是否具有致病性。

幼苗病癥特點：1）接種黃曲霉。室內幼苗發(fā)芽率與對照相比，無明顯差異，幼苗正常。2）接種鐮刀菌。用2 菌餅/5 mL 濃度菌液處理過的種子，幼苗染病，輕者能發(fā)芽，但生長細弱，嚴重的不能發(fā)芽；幼苗染病后在芽鞘上產生黃褐色斑，邊緣清晰，中間稍褪色。3）接種黑粉菌。用2 菌餅/5 mL 濃度菌液處理過的種子，發(fā)病情況較其他處理無顯著差異，但幼苗長勢較弱，不正常幼苗與對照相比存在差異。

病株病癥特點：1）小麥根部出現(xiàn)深褐色病斑，根部組織呈絮狀纖維。2）麥穗中上部出現(xiàn)黑色病癥。3）秸稈中下部出現(xiàn)同心圓環(huán)狀褐色病斑。

對發(fā)病組織進行分離純化后獲得兩種菌種，利用形態(tài)特征分析法確定兩種菌種類型分別為黑粉菌和鐮刀菌。根據(jù)柯赫氏法則確定鐮刀菌和黑粉菌為小麥種子攜帶的致病菌，并分別引起了小麥莖基腐病和黑粉病。

4 取得的主要成果

4.1 確定了淄博市小麥種子基地帶菌情況分布

通過對淄博市小麥種子生產基地生產的小麥種子健康度檢測，小麥種子帶菌率超過30%的樣品產地主要集中在高青縣，未經篩選加工的小麥種子帶菌率遠高于經篩選加工的小麥種子。

4.2 鑒定致病菌兩種

采用組織分離法，對未經篩選的小麥種子樣品進行菌種分離、純化，獲得3 種純化的菌種，分別是黃曲霉、黑粉菌和鐮刀菌；對經過篩選的小麥種子樣品進行菌種分離、純化，獲得兩種純化的菌種，分別是黑粉菌和鐮刀菌。根據(jù)柯赫氏法則要求，進行3 種病原菌的致病性測定，最終確定黑粉菌和鐮刀菌為小麥種子攜帶的致病菌，分別引起小麥黑粉病和莖基腐病。

4.3 制定小麥種子健康度檢測技術操作規(guī)范

通過對病原菌的分離、純化，病原菌鑒定，致病性檢測等技術研究及結果分析，制定了淄博市小麥種子健康度檢測技術操作規(guī)范，為今后淄博市小麥種子健康度檢測提供了技術支撐。

4.4 研究配制3 種高效小麥種衣劑

通過室內生物活性測定和田間試驗，對8 種殺菌劑進行防治效果比對，最終篩選出3 種對小麥莖基腐病和黑粉病具有較好防治效果的種衣劑，分別是5%苯甲·戊唑醇種子處理懸浮劑、2%戊唑醇懸浮種衣劑、30 g/L 苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑。

4.5 開展小麥種衣劑推廣應用

將3 種高效小麥種衣劑在桓臺縣、臨淄區(qū)和高青縣通過種子企業(yè)進行推廣應用，3 年累計推廣面積達18.6 萬hm2。