榮 光，徐向東,2，彭維祺，孫衛(wèi)平，夏萬(wàn)良，張潤(rùn)峰

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；2.湖北師范大學(xué)，湖北黃石 435000）

膠體金免疫層析技術(shù)（Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)是建立在膠體金、免疫層析、單克隆抗體、新材料、乳膠凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法基礎(chǔ)之上發(fā)展起來(lái)的一種新型固相免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)[1]。該技術(shù)誕生于20 世紀(jì)90 年代初[2]，經(jīng)過(guò)30 多年的不斷發(fā)展，該技術(shù)在生物醫(yī)藥學(xué)、植物檢疫、食品安全檢測(cè)、農(nóng)牧業(yè)、重金屬殘留檢測(cè)以及動(dòng)物疫病診斷等各大領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3,4]。與其他技術(shù)領(lǐng)域相比，GICA 在動(dòng)物疫病診斷方面應(yīng)用起步較晚，卻發(fā)展迅速，已經(jīng)成為當(dāng)前動(dòng)物疫病診斷中最簡(jiǎn)單、快速、敏感的檢測(cè)技術(shù)之一。因該技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、成本低、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，適合廣大基層技術(shù)人員大批量檢測(cè)和普查等，具有巨大的潛力和廣闊的前景[5]。本文就GICA 的原理、特點(diǎn)、分類及在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 膠體金免疫層析技術(shù)

1.1 膠體金免疫層析技術(shù)的原理

膠體金免疫層析技術(shù)是一種以膠體金為示蹤標(biāo)志物檢測(cè)特定抗原或抗體的一種新型的固相免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。它的原理是以硝酸纖維素膜（NC)作為固相載體，將標(biāo)記了膠體金的抗原或抗體固定在硝酸纖維素膜（NC)上。檢測(cè)時(shí)，在樣品墊上加入待測(cè)樣品，樣品通過(guò)毛細(xì)作用沿層析方向向前移動(dòng)。當(dāng)待測(cè)樣品中的待測(cè)物泳動(dòng)至膠體金結(jié)合墊，與膠體金結(jié)合墊上的受體（抗原或抗體)發(fā)生特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在檢測(cè)線，短時(shí)間內(nèi)（5～10min)，可通過(guò)膠體金的顏色反應(yīng)目測(cè)得到試驗(yàn)結(jié)果[6-8]。

1.2 膠體金免疫層析技術(shù)的特點(diǎn)

膠體金免疫層析技術(shù)在診斷技術(shù)中能夠快速發(fā)展的主要原因是其具有以下特點(diǎn)。

1.2.1 生產(chǎn)成本低

試紙組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)中使用的設(shè)備及耗材成本低，相對(duì)易于制造和進(jìn)行批量生產(chǎn)[9]。

1.2.2 操作簡(jiǎn)單、快速

膠體金免疫層析技術(shù)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需專業(yè)的儀器設(shè)備、專業(yè)的人員，樣品也無(wú)需處理。一般情況下，5～10min 內(nèi)直接通過(guò)目測(cè)得到直觀的檢測(cè)結(jié)果[10-12]。

1.2.3 應(yīng)用范圍廣

膠體金免疫層析技術(shù)可檢測(cè)的樣品多樣，如體液、唾液、尿液、全血、血漿、血清等；該技術(shù)既可以檢測(cè)抗體，也可以檢測(cè)抗原，目前廣泛用于生物醫(yī)藥、植物檢疫、食品安全檢測(cè)、農(nóng)牧業(yè)、重金屬殘留檢測(cè)、動(dòng)物疫病診斷、獸藥殘留檢測(cè)等領(lǐng)域[3,9]。

1.2.4 靈敏度、特異性高

該技術(shù)用高質(zhì)量的單克隆抗體標(biāo)記膠體金，診斷下限可達(dá)10pg，并且對(duì)組織細(xì)胞的非特異性吸附作用小，故其靈敏度、特異性高[4,13]。

1.2.5 相對(duì)穩(wěn)定、安全環(huán)保

膠體金免疫層析試紙條的保質(zhì)期一般為12～24個(gè)月，通常不需要冷藏。試劑比較穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果能長(zhǎng)時(shí)間保存于室溫；無(wú)鄰苯二胺等有害物質(zhì)的參與，不會(huì)影響操作人員的健康，也不會(huì)污染環(huán)境[9,14]。

1.2.6 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，便于運(yùn)輸

該試紙條檢測(cè)時(shí)所需的試劑和樣本用量少，其中樣本用量低至1～2mL。同時(shí)該試紙條體積小，方便運(yùn)輸[4,15]。

1.3 膠體金免疫層析技術(shù)的分類

膠體金免疫層析技術(shù)根據(jù)其原理的不同，可分為間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。其中，夾心法又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法。間接法大多用于檢測(cè)抗體，常用于病毒或細(xì)菌相應(yīng)血清抗體的檢測(cè)；競(jìng)爭(zhēng)法多用于檢測(cè)僅含有一個(gè)免疫結(jié)合位點(diǎn)的小分子抗原，例如嗎啡；雙抗體夾心法多用于檢測(cè)多表位抗原，常應(yīng)用于病毒的檢測(cè)；雙抗原夾心法多用于對(duì)病原相應(yīng)抗體的檢測(cè)[16-18]。

2 在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用

2.1 在動(dòng)物病毒性疾病診斷中的應(yīng)用

目前，根據(jù)相關(guān)調(diào)查和分析發(fā)現(xiàn)病毒性疾病是導(dǎo)致畜牧行業(yè)動(dòng)物出現(xiàn)疫情的主要原因[19]。在預(yù)防和控制疫情發(fā)生方面，準(zhǔn)確快速、簡(jiǎn)便安全的膠體金免疫層析技術(shù)顯得尤為重要，該技術(shù)在動(dòng)物病毒性疫病診斷中也得到廣泛的應(yīng)用。

丁豪杰等[20]用豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2)重組衣殼蛋白（dCap)，研制了檢測(cè)PCV2-dCap 抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。結(jié)果顯示，該方法具有良好的特異性、敏感性以及較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。該檢測(cè)方法和ELISA 相比較，結(jié)果顯示陽(yáng)性符合率為90.5%，陰性符合率為100%，總符合率為91%。Yu[21]等利用鴨坦布蘇病毒（DTMUV)的E 蛋白特異性抗體建立了快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒（DTMUV)的膠體金免疫層析試紙條，檢測(cè)了50 份臨床樣本，該檢測(cè)方法與RT-PCR 符合率為93.9%。程婷婷[22]等以O(shè)MP31 與BP26 重組蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了一種快速檢測(cè)布魯氏菌抗體的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條與其他不相關(guān)疾病無(wú)交叉反應(yīng)，特異性高。經(jīng)檢測(cè)，該試紙條與琥紅平板試驗(yàn)方法符合率為92%，說(shuō)明其具有良好的使用價(jià)值，可在基層推廣使用。李昕等[23]利用雙抗體夾心法建立了檢測(cè)口蹄疫O、A、Asia1 型病毒膠體金免疫層析定量檢測(cè)試紙卡，其不僅在O、A、Asia1 血清型口蹄疫病毒間無(wú)交叉反應(yīng)，與其他非口蹄疫病毒也無(wú)交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于快速鑒別口蹄疫病毒抗原、146S 定量檢測(cè)以及血清分型。

2.2 在動(dòng)物細(xì)菌性疾病診斷中的應(yīng)用

最近幾年，動(dòng)物細(xì)菌性疾病在中國(guó)部分地區(qū)呈多發(fā)狀態(tài)，在一定程度上嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。膠體金免疫層析技術(shù)在諸如布魯氏菌病等細(xì)菌性疾病的診、監(jiān)測(cè)和檢測(cè)斷中發(fā)揮了極大作用。

許菲菲等[24]基于BP26 蛋白，將BP26 蛋白包被檢測(cè)線（T)，兔BRU-BP26 抗體包被質(zhì)控線（C)，研制出了羊布魯氏菌抗體金標(biāo)檢測(cè)試紙條。該方法的特異性和靈敏度分別為94.44%、90.62%，與試管凝集試驗(yàn)總符合率為92.69%。此外，與大腸桿菌O∶157 等6 種細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明該試紙條是診斷羊布魯氏病的理想方法。趙越等[25]以重組表位蛋白map0862-2154c 為抗原，建立了牛副結(jié)核分枝桿菌抗體膠體檢測(cè)方法。用該方法在臨床樣本血清檢測(cè)結(jié)果顯示，其敏感性為91.86%，特異性為94.23%，符合率為93.38%，為檢測(cè)牛副結(jié)核病的血清抗體提供了簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性高的檢測(cè)手段。趙肖等[26]研制了可同時(shí)檢測(cè)Mhp 血清抗體和黏膜抗體的豬肺炎支原體抗體膠體金免疫層析試紙條。該試紙條只需10min 即可得到檢測(cè)結(jié)果，其與商品化的Mhp ELISA 試劑盒的檢測(cè)符合率為96.1%，對(duì)豬肺炎支原體的診斷提供了快速檢測(cè)技術(shù)。

2.3 在寄生蟲(chóng)病診斷中的應(yīng)用

相比于其他疾病，膠體金免疫層析技術(shù)在寄生蟲(chóng)病診斷的應(yīng)用相對(duì)較少，但這方面也有較多的研究成果。

丁豪杰等[27]將膠體金標(biāo)記VHH-48 和VHH-52抗體蛋白并制備金標(biāo)墊，再將日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原（SEA)作為檢測(cè)線包被物，羊抗鼠IgG 作為質(zhì)控線包被物，建立了基于抗日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原納米抗體的膠體金試紙條檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法特異性和敏感性良好。寇金華等[28]利用膠體金標(biāo)記抗弓形蟲(chóng)表面抗原SAG3 單克隆抗體，制備豬弓形蟲(chóng)血清循環(huán)抗原免疫膠體金試紙條。該試紙的靈敏度可達(dá)1∶160，在特異性方面，與豬囊蟲(chóng)陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。該試紙條在室溫條件下，可保存1 個(gè)月以上，具有較好的穩(wěn)定性。楊升等[29]建立了新孢子蟲(chóng)感染牛血清抗體的檢測(cè)方法。該試紙條以兔抗SPA 包被為質(zhì)控線，新孢子蟲(chóng)P40 蛋白包被為檢測(cè)線進(jìn)行制備。經(jīng)過(guò)測(cè)試，該試紙條特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于監(jiān)測(cè)牛新孢子蟲(chóng)的感染。

3 小結(jié)

迄今為止，膠體金免疫層析技術(shù)因具備多種優(yōu)點(diǎn)，是目前最成功的商業(yè)化POCT 產(chǎn)品之一，也是多個(gè)領(lǐng)域研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。因此，該技術(shù)一直處于被創(chuàng)新和優(yōu)化狀態(tài)。當(dāng)前，膠體金免疫層析技術(shù)已相對(duì)成熟，具有廣闊的發(fā)展前景。但是該技術(shù)還有一些不足之處，如質(zhì)控體系不夠嚴(yán)密；相比于其他技術(shù)，靈敏度低，易導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生；難以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)；不能實(shí)現(xiàn)抗原抗體的同步檢測(cè)等。所以，膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)充分利用自身優(yōu)點(diǎn)的情況下，朝著實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)、提高靈敏度、實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)以及抗原抗體的同步檢測(cè)等方面發(fā)展，發(fā)揮該技術(shù)最大的價(jià)值，持續(xù)為中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展保駕護(hù)航[30,31]。