陳新亮 房伯平 王章英 姚祝芳 楊義伶 黃立飛

摘要

為明確引起國家種質(zhì)廣州甘薯資源圃中病毒病的病毒種類及優(yōu)勢種，為甘薯種質(zhì)安全保存提供支持，2017年從甘薯資源圃中未脫毒更新的盆栽苗和大田苗中采集155份具有不同病毒病癥狀的甘薯資源樣品，利用PCR和RTPCR檢測技術(shù)對這些樣品進(jìn)行了17種病毒的分子檢測。155份樣品均有病毒檢出，包括甘薯羽狀斑駁病毒Sweet potato feathery mottle virus（SPFMV）、甘薯褪綠矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV）、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）、甘薯褪綠斑病毒Sweet potato chlorotic fleck virus（SPCFV）、甘薯類花椰菜花葉病毒Sweet potato caulimolike virus（SPCV）、甘薯潛隱病毒Sweet potato latent virus（SPLV）、甘薯脈花葉病毒Sweet potato vein mosaic virus （SPVMV）、甘薯病毒2 Sweet potato virus 2（SPV2）和甘薯曲葉病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）等9種病毒。檢出率最高的是SPCFV，為98.1%，最低的是SPCV，為0.6%;RNA病毒檢出率為99.4%，DNA病毒檢出率為94.2%。154份樣品為病毒復(fù)合侵染，占總樣品數(shù)的99.4%;其中4～6種病毒復(fù)合侵染率最高，為70.7%，有4份樣品最多檢測出8種病毒（2.6%）。 在所有復(fù)合侵染類型中，同時含有SPFMV和SPCSV兩種病毒的復(fù)合侵染率占54.2%。研究結(jié)果表明，甘薯種質(zhì)資源經(jīng)過多年莖蔓和種薯繁育，病毒感染率高，病毒種類多，以復(fù)合侵染為主，在生長環(huán)境相同的條件下，不同資源品種對病毒的耐受情況存在明顯差異。

??關(guān)鍵詞

甘薯;種質(zhì)資源;病毒病;復(fù)合侵染

中圖分類號：

S435.311

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020557

Identification and analysis of viruses in the national germplasm nursery for sweet potato（Guangzhou）

CHEN Xinliang，F(xiàn)ANG Boping，WANG Zhangying，YAO Zhufang，YANG Yiling，HUANG Lifei*

（Crop Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangdong

Key Laboratory of Crops Genetics Improvement， Guangzhou510640， China）

Abstract

In order to investigate the virus and dominant virus species causing sweet potato virus disease in the national sweet potato germplasm Guangzhou resource nursery， provide support for the safe preservation of resources， a total of 155 samples with viral symptoms were collected from potted seedlings and field seedlings in nursery in 2017. Molecular detection of viruses in the samples were carried out by PCR or RTPCR using primers for seventeen viruses. The results showed that nine virus species were detected， including Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）， Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）， Cucumber mosaic virus （CMV）， Sweet potato chlorotic fleck virus （SPCFV）， Sweet potato caulimolike virus （SPCV）， Sweet potato latent virus （SPLV）， Sweet potato vein mosaic virus （SPVMV）， Sweet potato virus 2 （SPV2） and Sweet potato leaf curl virus （SPLCV）. Among which， SPCFV had the highest detection rate of 98.1%， and SPCV had the lowest detection rate of 0.6%. The detection rate of RNA viruses was 99.4%， and that of DNA viruses was 94.2%. One hundred and fiftyfour samples （99.4%） were found to be infected by two or above viruses. Specifically， coinfection by 4 6 kinds of viruses were major type， accounting for 70.7%. A total of eight viruses were detected in four samples （2.6%）. Combined infection contained SPFMV and SPCSV was the most common， accounting for 54.2%. In short， some germplasm resources of sweet potato have been infected by different viruses with high infection rates and mixed infection was dominant. The tolerance of different resources to the virus is obviously different under the same growth environment.

Key words

sweet potato;germplasm resources;virus disease;coinfection

甘薯Ipomoea batatas （L.） Lam.是世界上重要的糧食作物以及食品加工和工業(yè)原料[1]。甘薯種質(zhì)資源是進(jìn)行甘薯生產(chǎn)和育種工作的基礎(chǔ)，也是生物學(xué)研究的重要材料。我國于1952年-1958年和1979年-1982 年分別進(jìn)行了全國性甘薯種質(zhì)資源的普查收集工作。在此基礎(chǔ)上，分別于1990年和1996年建立了“國家種質(zhì)廣州甘薯圃”和“國家種質(zhì)徐州甘薯試管苗庫”，負(fù)責(zé)全國甘薯品種資源的收集保存、整理與分發(fā)利用等工作[2]。至今廣州甘薯圃保存各類種質(zhì)資源2 500多份，其中國家編目的甘薯種質(zhì)資源1 380份。近年來生產(chǎn)上甘薯病毒病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重，新收集到的種質(zhì)資源也不時發(fā)現(xiàn)感染了病毒，資源圃中部分資源表現(xiàn)出明顯的病毒病癥狀，而危害甘薯種質(zhì)資源的病毒種類和主要病毒類型并不明確，對甘薯種質(zhì)資源的安全保存構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

目前，全世界已報道的危害甘薯的DNA和RNA病毒有38種，分別屬于9個科，包括雀麥花葉病毒科Bromoviridae（1種）、布尼亞病毒科Bunyaviridae（1種）、花椰菜花葉病毒科Caulimoviridae（3種）、長線形病毒科Closteroviridae（1種）、伴生豇豆花葉病毒科Secoviridae（1種）、線性病毒科Flexiviridae（1種）、雙生病毒科Geminiviridae（15種）、黃癥病毒科Luteoviridae（1種）和馬鈴薯Y病毒科Potyviridae（9種）[3 4]。中國報道的侵染甘薯常見病毒種類包括甘薯褪綠矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV）、甘薯羽狀斑駁病毒Sweet potato feathery mottle virus（SPFMV）、甘薯曲葉病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）、甘薯G病毒Sweet potato virus G（SPVG）、甘薯潛隱病毒Sweet potato latent virus（SPLV）、 甘薯類花椰菜花葉病毒Sweet potato caulimolike virus（SPCV）、 甘薯褪綠斑病毒Sweet potato chlorotic spot virus（SPCFV）、甘薯脈花葉病毒Sweet potato vein mosaic virus（SPVMV）和黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）等[1，5]。甘薯作為無性繁殖作物，主要靠莖枝栽插種植，一旦感染病毒，病毒就會在甘薯體內(nèi)不斷增殖、積累、代代相傳，然后經(jīng)過粉虱、蚜蟲等昆蟲或汁液傳播，復(fù)合侵染率較高。甘薯病毒的檢測方法主要有生物學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)等，生物學(xué)方法是根據(jù)樣品或指示植物表型特征初步判定樣品是否感染病毒。血清學(xué)檢測技術(shù)主要為酶聯(lián)免疫吸附，能準(zhǔn)確判斷病毒的種類[6 7]。分子生物學(xué)檢測技術(shù)包括PCR、RTPCR、qPCR、核酸序列測定、RCARFLP以及siRNA 深度測序等，其中PCR或RTPCR技術(shù)是檢測植物病毒的常用方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高的特點(diǎn)[8 9]。

本研究在對資源品種病毒病癥狀調(diào)查的基礎(chǔ)上，利用PCR及多重RTPCR檢測技術(shù)對甘薯種質(zhì)資源中出現(xiàn)典型病毒癥狀的樣品進(jìn)行分子檢測，明確發(fā)病甘薯資源品種攜帶病毒的具體種類和發(fā)生頻率，為甘薯種質(zhì)資源的安全保存及生產(chǎn)上病毒病防控提供理論依據(jù)，為后期研究抗（耐）病毒品種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試樣品：2017年9月自廣州甘薯資源圃的盆栽和大田苗采集呈現(xiàn)斑點(diǎn)、花葉、黃化、畸形和矮化等疑似病毒病癥狀的甘薯樣品155份，其中溫室大棚盆栽類樣品100份，大田種植類樣品55份。

試劑和儀器：Plant RNA Kit、HP Plant DNA Kit，美國Omega BioTek公司;EasyScript OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，全式金生物技術(shù)有限公司;2×Taq Master Mix （With Dye），美國APExBIO Technology LLC公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Biometra TAdvanced PCR儀，德國TAdvanced basiseinheit（耶拿）公司;DYY6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司;Tanon 4100型凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1病毒病害的癥狀觀察

于2017年9月對國家種質(zhì)廣州甘薯資源圃保存的資源品種進(jìn)行病毒病癥狀觀察，選取具有病毒病癥狀的植株葉片。其中溫室疑似病毒樣品為2016年10月-11月從大田取苗種植在溫室中的盆栽苗，大田疑似病毒樣品為2016年資源收獲薯塊繁育苗并于2017年7月種植于大田。所采集樣品及時置于冰盒中，盡快經(jīng)液氮速凍后置于 80℃冰箱中保存，用于分子生物學(xué)鑒定。

1.2.2病毒樣品的分子鑒定

分別取約100 mg混勻后的樣品提取總RNA和DNA。RNA病毒檢測：先通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。取RNA模板約1 μg，65℃變性5 min，取出冰浴2 min，再加入Anchored Oligo（dT）18 Primer （0.5 μg/μL） 1 μL， Easy Script RT/RI Enzyme Mix 1 μL， 2×ES Reaction Mix 10 μL，RNaseFree H2O補(bǔ)足至20 μL，42℃恒溫15 min，85℃恒溫5 s。通過RNA病毒特異引物（引物序列見表1）進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，RTPCR反應(yīng)體系（25 μL）： 合成的cDNA 2 μL，2×Taq Master Mix （With Dye） 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L） 各1 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，退火45 s （溫度見表1， 多重PCR檢測參照相關(guān)方法），68℃ 1 min，30次循環(huán);68℃ 10 min。DNA病毒檢測：采用DNA病毒特異引物（引物序列見表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，反應(yīng)體系（25 μL）：樣品總DNA（約100 ng/μL） 2 μL，2×Taq Master Mix （With Dye） 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，8.5 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min;94℃ 30 s，退火45 s（退火溫度見表1），68℃ 1 min，30次循環(huán);68℃ 10 min。所有檢測均包含以水為模板的陰性對照。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀觀察拍照。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理。

2結(jié)果與分析

2.1病株的癥狀類型

根據(jù)甘薯病毒病害的發(fā)病部位和癥狀特征可以分為以下6種主要類型。1）葉片斑點(diǎn)型：葉片周圍出現(xiàn)紫褐色，形成紫斑、紫環(huán)斑、黃色斑或者枯斑。多數(shù)品種沿葉脈形成典型的紫色羽狀斑（圖1a）。2）曲葉型： 一般多是葉片邊緣上卷，嚴(yán)重者可形成杯狀（圖1b）。3）花葉型：葉脈出現(xiàn)不規(guī)則黃綠相間的花葉斑紋，嚴(yán)重時葉片大部分呈黃綠色，中間雜有綠色斑塊（圖1c）。4）葉片黃化型：包括葉片黃化及網(wǎng)狀黃脈，發(fā)病植株展開的心葉出現(xiàn)網(wǎng)紋狀黃化現(xiàn)象（圖1d）。5）葉片皺縮型：葉面凹凸不平且粗糙，葉緣不整齊，皺縮缺刻較多，呈蕨葉狀或扭曲狀（圖1e）。6）矮化叢枝型：全株畸形矮化，縮節(jié)叢生，葉片明顯細(xì)?。▓D1f）。癥狀調(diào)查結(jié)果表明，不同甘薯品種的感病植株表現(xiàn)出不同的癥狀特點(diǎn)，同一品種的不同感病植株感病癥狀基本相似但也存在差異。

2.2病毒的種類和檢出率

155份樣品共檢測到9種病毒，包括雀麥花葉病毒科1種（CMV），雙生病毒科1種（SPLCV），花椰菜花葉病毒科1種（SPCV），線性病毒科1種（SPCFV），長線形病毒科1種（SPCSV），馬鈴薯Y病毒科4種（SPFMV、SPLV、SPV2、SPVMV），未檢測到SPVG、SPVC、SPMMV、SPMSV、TMV、SPBVA、SPSMV1和SPVCV。其中SPCFV檢出率最高，為98.1%，SPLCV檢出率為94.2%， SPLV檢出率為91.0%，SPCSV檢出率為72.3%，SPFMV檢出率為57.4%，CMV檢出率為38.1%，SPVMV檢出率為24.5%，SPV2檢出率為18.7%， SPCV檢出率為0.6%（圖2）。SPCFV、SPLV、SPCSV、SPFMV、CMV和SPV2等RNA病毒檢出率為99.4%，SPLCV和SPCV等DNA病毒檢出率為94.2%，SPCFV、SPLCV和SPLV等3種病毒檢出率均在90%以上，為甘薯資源病毒病的優(yōu)勢種類。

2.3病毒的復(fù)合侵染

155份樣品中，有154份樣品為2種及以上病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為99.4%，其中2種病毒復(fù)合侵染率為2.6%，復(fù)合類型有3種，SPCFV和SPLCV復(fù)合侵染比率最高（2份）;3種病毒復(fù)合侵染率為12.3%，復(fù)合類型有4種，SPCFV、SPLV和SPLCV復(fù)合侵染率最高（14份）;4種病毒復(fù)合侵染率為22.7%，復(fù)合類型有9種，SPCSV、SPCFV、SPLV和SPLCV復(fù)合侵染率最高（14份），其次為CMV、SPCFV、SPLV 和SPLCV復(fù)合侵染（12份）;5種病毒復(fù)合侵染率最高，占26.6%，復(fù)合類型有10種，SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV和SPLCV復(fù)合侵染率最高（25份）;6種病毒復(fù)合侵染率為21.4%，復(fù)合類型有6種，SPFMV、SPCSV、CMV、SPCFV、SPLV和SPLCV復(fù)合侵染率最高（16份）（圖3）。7種病毒復(fù)合侵染率為11.7%，復(fù)合類型有3種，分別是SPFMV、SPV2、SPCSV、SPCFV、SPLV、SPVMV和SPLCV（7份），SPFMV、SPV2、SPCSV、CMV、SPCFV、SPLV和SPLCV（6份），SPFMV、SPCSV、CMV、SPCFV、SPLV、SPVMV和SPLCV（5份）;8種病毒復(fù)合侵染率為2.6%，復(fù)合類型為 SPCFV、SPLCV、SPLV、SPCSV、SPFMV、SPVMV、SPV2和CMV，有4份樣品檢測出;4～6種病毒復(fù)合侵染率最高為70.7%;多種病毒的復(fù)合侵染中包括對甘薯生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV） 的比率為54.2%。

3結(jié)論與討論

癥狀觀察是判斷樣品是否感染病毒最直觀的方法，例如甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）感染后老葉片上多出現(xiàn)脈明、葉脈上出現(xiàn)紫色羽狀紋，褪綠斑點(diǎn)等癥狀。然而病毒往往復(fù)合侵染甘薯，而某些甘薯品

種本身又具有耐病性，因此僅通過癥狀診斷確定病毒種類是不夠確切的[5]。本研究在取樣前對受病毒危害嚴(yán)重的種質(zhì)資源品種進(jìn)行了表型癥狀特征調(diào)查，受病毒危害的甘薯主要表現(xiàn)為葉片上出現(xiàn)褪綠斑、形成黃斑、紫斑、紫環(huán)斑，葉片卷曲，葉片邊緣呈紫色，植株矮化等明顯的病毒病特征。分子檢測結(jié)果顯示甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）和甘薯曲葉病毒（SPLCV）檢出率最高，均在90%以上，與表型癥狀調(diào)查結(jié)果相吻合。SPCFV單獨(dú)侵染甘薯時癥狀輕微，但該病毒與甘薯褪綠矮化病毒 （SPCSV） 共同侵染時可導(dǎo)致甘薯產(chǎn)生嚴(yán)重的癥狀[19]。SPCFV在云南、廣西、山東和福建等地的檢出率較低或未檢測到[20 22]，可能還未大范圍傳播。廣東地區(qū)甘薯曲葉病毒由湯亞飛等于2013年首次報道，該病毒危害癥狀明顯，主要引起葉片卷曲，嚴(yán)重時卷曲呈杯狀，由煙粉虱Bemisia tabaci以持久方式傳播[23]。甘薯潛隱病毒（SPLV）的檢出率也高達(dá)91%，該病毒侵染甘薯一般不產(chǎn)生明顯的葉部癥狀，有的僅產(chǎn)生輕度斑駁，可隨薯塊和薯苗進(jìn)行傳播[24]。另外，甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）在本研究中檢出率為72.3%。SPCSV的相關(guān)報道比較多，是危害甘薯的重要病毒，通常與其他病毒協(xié)同侵染，危害癥狀明顯。本次檢測中還發(fā)現(xiàn)了黃瓜花葉病毒（CMV），檢出率為38.1%，該病毒株系繁多，寄主廣泛，是豆類、草本觀賞植物、蔬菜及果樹上發(fā)生最廣、危害最大的病毒，該病毒通過機(jī)械摩擦和蚜蟲非持久方式傳播，引起植株嚴(yán)重矮化、褪綠和黃化[25 26]，重慶、廣西和福建等地均有該病毒危害甘薯的相關(guān)報道。

甘薯為無性繁殖作物，容易感染病毒并造成病毒的積累，病毒傳播方式主要有種薯和薯塊帶毒、蚜蟲持久性和非持久性傳播、粉虱非持久性傳播及機(jī)械摩擦傳播，多種傳播方式導(dǎo)致甘薯可以被多種病毒復(fù)合侵染。本研究中，除1份樣品僅被甘薯曲葉病毒（SPLCV）危害外，其余154份資源樣品均被2種及以上的病毒復(fù)合侵染，且4～6種病毒復(fù)合侵染率達(dá)70.7%。云南、山東等地的甘薯生產(chǎn)田中病毒檢測結(jié)果顯示，復(fù)合侵染中多以2～3種病毒為主，這說明甘薯資源經(jīng)過連續(xù)多年莖枝栽插種植后，相比大田種植的甘薯累積了更多種類的病毒。此外，復(fù)合侵染中有4份樣品檢測到8種病毒，分別為SPCFV、SPLCV、SPLV、SPCSV、SPFMV、SPVMV、CMV和SPV2，這在以前的報道中很少見。黃利利等在廣西南寧的病毒樣品檢測中也曾檢測到8種病毒復(fù)合侵染，所不同的是本次檢測未發(fā)現(xiàn)甘薯G病毒（SPVG），而廣西樣品中檢測到SPVG，未檢測到SPV2[20]。這兩種病毒均屬于馬鈴薯Y病毒科，在國內(nèi)外不同地區(qū)均有報道，能夠依靠機(jī)械、蚜蟲和粉虱傳播。

目前，為了保障國家甘薯種質(zhì)資源的安全，已經(jīng)通過莖尖分生組織培養(yǎng)的方法對國家種質(zhì)廣州甘薯圃保存的大部分資源品種進(jìn)行了脫毒更新和試管苗保存。后期，將加強(qiáng)對入圃品種的病毒檢測，并按品種對病毒的抗（耐）情況進(jìn)行分類管理。本研究明確了甘薯種質(zhì)資源中病毒的種類和發(fā)生頻率，完善了甘薯多病毒檢測技術(shù)，為病毒病防控、資源保存和脫毒種苗生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。

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收稿日期：2020? 10? 22修訂日期：2021 01 07

基金項(xiàng)目：

國家農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用項(xiàng)目（NWB014）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（甘薯）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS10B5，CARS10C17）;廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系甘薯馬鈴薯創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2019KJ111）

* 通信作者

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