崔紅紅 張幸媛 田宇豪 甘斌 尹燕 胡新喜 熊興耀 秦玉芝

摘要

為了解湖南省馬鈴薯種薯質(zhì)量和主要病毒病發(fā)生情況，2019年-2020年馬鈴薯秋作和冬作期間，對(duì)長(zhǎng)沙、益陽(yáng)、湘潭、澧臨等馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)的155個(gè)馬鈴薯樣品，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（DASELISA） 技術(shù)，篩查6種主要馬鈴薯病毒，包括馬鈴薯X病毒 Potato virus X （PVX）、馬鈴薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、馬鈴薯M病毒Potato virus M （PVM）、馬鈴薯S病毒Potato virus S （PVS）、馬鈴薯A病毒Potato virus A （PVA）、馬鈴薯卷葉病毒Potato leaf roll virus（PLRV）。檢測(cè)結(jié)果表明：6種馬鈴薯病毒病在湖南均有不同程度的發(fā)生，單一和兩種病毒復(fù)合感染植株占比最高，其次是3種病毒復(fù)合感染，存在極少數(shù)植株復(fù)合感染4～5種病毒病情況。在秋作馬鈴薯中，PVY檢出率達(dá)到29.41%;PVS和PVA檢出率均為27.94%;PVM、PVX、PLRV的檢出率分別為20.59%、19.12%、17.65%。在冬作馬鈴薯中，PVX 檢出率最高，達(dá)到31.03%;其次是PLRV，檢出率為25.29%;PVS、PVM、PVA、PVY的檢出率依次為19.54%、16.09%、10.34%、5.75%。綜上所述，近年來(lái)湖南地區(qū)馬鈴薯病毒病發(fā)生有抬頭之勢(shì)，其中PVX和PVY最為嚴(yán)重，復(fù)合感染增加，受天氣和種源影響，秋作馬鈴薯比冬作馬鈴薯情況嚴(yán)重。

??關(guān)鍵詞

馬鈴薯;病毒病;調(diào)查鑒定;RTPCR;DASELISA

中圖分類(lèi)號(hào)：

S435.32

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020541

Investigation on occurrence of potato virus disease in Hunan province

CUI Honghong1，ZHANG Xingyuan1，TIAN Yuhao1，GAN Bin1，YIN Yan1，HU Xinxi1，XIONG Xingyao2，QIN Yuzhi1*

（1. College of Horticulture，Hunan Agricultural University， ERC for Horticultural Crop Germplasm

Creation and New Variety Breeding，Ministry of Education， Changsha410128， China; 2.Agricultural

Genomics Institute at Shenzhen， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shenzhen518120， China）

Abstract

To clear the quality of seed potato tubers and the occurrence of major virus diseases in Hunan province， 155 potato samples from Changsha， Yiyang， Xiangtan and Lilin potato production areas from 2019 to 2020 were screened for six major potato viruses， including Potato virus X （PVX）， Potato virus Y （PVY）， Potato virus M （PVM）， Potato virus S （PVS）， Potato virus A （PVA）， Potato leaf roll virus （PLRV）by? reverse transcription polymerase chain reaction （RTPCR） and double antibody sandwich enzymelinked immunosorbent assay （DASELISA）. The results showed that six potato virus occurred in different degrees in Hunan province. The proportion of single and two kinds of virus infection was the highest， followed by three kinds of virus infection， while there were very few plants infected with 4 5 kinds of virus diseases. In autumn potatoes， the detection rate of PVY reached 29.41%， those rates of PVS and PVA were 27.94%， while those of PVM， PVX and PLRV were 20.59%， 19.12% and 17.65%， respectively. In winter potatoes， the detection rate of PVX was the highest （31.03%）， followed by PLRV （25.29%）， while those of PVS， PVM， PVA and PVY were 19.54%， 16.09%， 10.34% and 5.75%， respectively. In conclusion， in recent years， the occurrence of potato virus diseases in Hunan province has been on the rise， especially PVX and PVY are the most serious， and the mixed infection is increasing. Affected by weather and provenance， the situation of virus infection in autumn potato is more serious than that in winter potato.

Key words

potato;viral disease;investigation;RTPCR;DASELISA

馬鈴薯Solanum tuberosum是一種分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物。中國(guó)是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)之一，隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴(kuò)大，馬鈴薯受病毒病危害也越來(lái)越嚴(yán)重。病毒病導(dǎo)致的馬鈴薯植株退化，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量，可使馬鈴薯減產(chǎn)20%～50%不等[1 3]。

已報(bào)道的馬鈴薯病毒病多達(dá)40種以上[4 6]，危害比較嚴(yán)重的主要有馬鈴薯X病毒 Potato virus X （PVX）、馬鈴薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、馬鈴薯M病毒Potato virus M （PVM）、馬鈴薯S病毒Potato virus S （PVS）、馬鈴薯A病毒Potato virus A （PVA）、馬鈴薯卷葉病毒Potato leaf roll virus（PLRV）。其中，PVY是侵染馬鈴薯最嚴(yán)重的病毒，在中國(guó)各地區(qū)的檢出率均較高。感染PVY的植株通常表現(xiàn)出重花葉或不同程度的壞死斑，危害嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)80%[7];PLRV引起馬鈴薯卷葉，對(duì)馬鈴薯的侵染僅次于PVY， 尤其是在內(nèi)蒙古自治區(qū)[8 12];其他4種病毒（PVX、PVS、PVM、PVA）單獨(dú)侵染馬鈴薯時(shí)，表現(xiàn)癥狀不明顯或不表現(xiàn)癥狀，復(fù)合侵染時(shí)會(huì)因病毒的數(shù)量、種類(lèi)、侵染的程度等不同而表現(xiàn)出不同程度的花葉、卷葉或壞死癥狀[13]。目前湖南地區(qū)馬鈴薯脫毒種薯應(yīng)用比例偏低，冬作馬鈴薯僅30%左右，薯農(nóng)在馬鈴薯秋作時(shí)則習(xí)慣自留種薯。本文通過(guò)對(duì)湖南馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病毒發(fā)生情況調(diào)查，以了解近年馬鈴薯病毒病發(fā)生情況和病毒種類(lèi)，為湖南地區(qū)馬鈴薯病毒病害防治提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

分別于2019年11月馬鈴薯秋作和2020年4月馬鈴薯冬作成熟期，從長(zhǎng)沙、益陽(yáng)、湘潭、澧臨等馬鈴薯生產(chǎn)地區(qū)進(jìn)行病毒病田間調(diào)查。采集有花葉、斑駁、卷葉、壞死等病毒癥狀的樣品，癥狀不明顯的地塊采取五點(diǎn)取樣法隨機(jī)取樣，樣品莖葉 80℃保存?zhèn)溆?。秋作采集樣?8個(gè)，冬作中采集樣品87個(gè)，共155個(gè)樣品。樣品包括‘湘馬鈴薯1號(hào)’‘費(fèi)烏瑞它’‘興佳2號(hào)’‘華薯1號(hào)’‘華薯2號(hào)’‘金湘’‘紫玉’等共42個(gè)品種（系）。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1DASELISA法

對(duì)所采集的155個(gè)樣品進(jìn)行DASELISA法檢測(cè)6種病毒：向預(yù)先包被馬鈴薯病毒捕獲抗體的微孔中，依次加入標(biāo)本、陰性和陽(yáng)性對(duì)照、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌，用底物TMB顯色， TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的馬鈴薯病毒含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），判定陰陽(yáng)性。DASELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司，具體步驟參照使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.2RTPCR法

抽取部分樣品提取植物總RNA，采用北京天根生化技術(shù)有限公司的總RNA提取試劑盒，以不含6種病毒的馬鈴薯為陰性對(duì)照，分別含6種病毒的馬鈴薯為陽(yáng)性對(duì)照。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司，具體步驟參照GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2說(shuō)明書(shū)操作。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板利用金牌Mix（購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);延伸72℃ 10 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[14]中的引物并結(jié)合Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，由擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯感染病毒病表型分析

本次調(diào)查過(guò)程中采集到的具有典型癥狀的樣品如圖1所示，表現(xiàn)為輕花葉，葉片褪綠，葉片顏色深淺不一，發(fā)生形變（b）;葉片出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)，顏色較暗（c）;葉片褪綠，出現(xiàn)斑點(diǎn)，葉邊緣以主脈為中心向上卷曲（d）;葉面粗糙，沒(méi)有光澤，葉片出現(xiàn)黃綠相間的斑點(diǎn)（e）;葉片出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)，葉邊緣以主脈為中心向上卷曲（f）;葉片中出現(xiàn)不規(guī)則的灼燒斑點(diǎn)，葉面粗糙，皺縮，葉片卷曲（g）;葉片顏色深淺不一，葉片中有不規(guī)則的灼燒斑點(diǎn)和青銅色枯斑，卷葉，植株下部葉片干枯（h）;葉片下垂，褪綠，出現(xiàn)青銅色枯斑，葉邊緣以主脈為中心向上卷曲（i）。

經(jīng)檢測(cè)，a無(wú)所檢測(cè)的6種病毒;b含PVX;c含PVY;d含PLRV;e含PVM;f含PLRV和PVY;g含PVA和PVM;h含PVS、PVX和PVY;i含PVS、PVA。

2.2DASELISA法檢測(cè)分析

采用DASELISA法對(duì)155個(gè)樣品（秋作中采集樣品68個(gè)，冬作中采集樣品87個(gè)），分別進(jìn)行6種病毒檢測(cè)。由表2可見(jiàn)，秋作馬鈴薯樣品中，不同病毒復(fù)合感染情況高發(fā)。其中單一病毒感染樣品占總樣品數(shù)量的33.82%;其次是2種馬鈴薯病毒復(fù)合感染的樣品占總樣品數(shù)量的30.88%;感染3種和4種馬鈴薯病毒的樣品較少，分別占總樣品數(shù)量的7.35%和4.41%;本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)有1.47%的樣本為5種馬鈴薯病毒復(fù)合感染。

冬作馬鈴薯樣品中，41.38%為單一病毒感染樣品，3種馬鈴薯病毒復(fù)合感染的樣品最少，占總樣品數(shù)量的5.75%;2種馬鈴薯病毒復(fù)合感染的樣品較多，占總樣品數(shù)量的21.84%。

由表3可見(jiàn)，在秋作馬鈴薯中，所檢測(cè)的6種主要馬鈴薯病毒均有涉及。感染PVY病毒的馬鈴薯樣品最多，占總樣品數(shù)量的29.41%; 感染PLRV病毒的馬鈴薯樣品最少，占總樣品數(shù)量的17.65%;感染PVA和PVS病毒的馬鈴薯樣品較多，均占總樣品數(shù)量的27.94%;感染PVX和PVM病毒的馬鈴薯樣品較少，分別占總樣品數(shù)量的19.12%和20.59%。

在冬作馬鈴薯中，所檢測(cè)的6種主要馬鈴薯病毒均有涉及。感染PVX病毒的馬鈴薯樣品最多，占總樣品數(shù)量的31.03%;感染PVY病毒的馬鈴薯樣品最少，占總樣品數(shù)量的5.75%;感染PLRV病毒的馬鈴薯樣品較多，占總樣品數(shù)量的25.29%;感染PVM和PVS病毒的馬鈴薯樣品較少，分別占總樣品數(shù)量的16.09%和19.54%;感染PVA病毒的馬鈴薯樣品占總樣品數(shù)量的10.34%。

在所采集的155個(gè)樣品中抽取8個(gè)樣品進(jìn)行RTPCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2。

將8個(gè)樣品DASELISA法和RTPCR法兩種方法檢測(cè)的結(jié)果整理見(jiàn)表4。由表4可知：除PVX之外，其他病毒兩種方法檢測(cè)的結(jié)果一致。

3討論

馬鈴薯病毒病是我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康、高效發(fā)展的主要障礙之一[15 19]。田間植株表型分析是病毒病發(fā)生調(diào)查最為便捷的方法，感染病毒的植株會(huì)隨感染病毒種類(lèi)、數(shù)量和程度等的不同而表現(xiàn)不同的癥狀（花葉、卷葉、皺縮、黃化、壞死），中等和重度單一病毒感染植株表現(xiàn)出典型的癥狀，田間調(diào)查易于辨識(shí)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，輕度感染和復(fù)合感染的植株，由于病毒種類(lèi)和感染程度的變化很難根據(jù)田間植株癥狀進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。如植株表現(xiàn)重度花葉癥狀，通常是PVY病毒感染引起的，但PVA與其他病毒混合感染時(shí)也會(huì)表現(xiàn)出花葉的癥狀。ELISA和RTPCR技術(shù)的應(yīng)用大大提高了馬鈴薯病毒病檢測(cè)的準(zhǔn)確性，其中，RTPCR技術(shù)由于其檢測(cè)成本較低和靈敏度好應(yīng)用日益廣泛。

2013年吳興泉等[20]和范國(guó)權(quán)等[21]分別對(duì)我國(guó)黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、云南等地馬鈴薯病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果均表明PVY和PVS為我國(guó)主要流行馬鈴薯病毒。2010年胡新喜等[22]對(duì)湖南省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)冬作馬鈴薯病毒種類(lèi)及流行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，PVS檢出率最高，其次是PVX和PVY。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，湖南秋作馬鈴薯中，PVY檢出率最高， 其次是PVS和PVA，復(fù)合感染高發(fā);在湖南冬作馬鈴薯中，檢出率最高的是PVX，其次是PLRV，該調(diào)查結(jié)果與10年前相比，PVS的檢出率降低，PVX的檢出率升高。湖南地區(qū)秋作馬鈴薯與冬作馬鈴薯相比較，前者病毒病發(fā)生種類(lèi)多，程度更嚴(yán)重，原因有二，一是種薯質(zhì)量的差異，秋作種薯大多是薯農(nóng)自留種甚至購(gòu)買(mǎi)商品薯做種，種薯帶毒普遍，蚜蟲(chóng)傳播病毒的毒源更多，冬作脫毒種薯使用率相對(duì)較高，種薯攜帶病毒較少，蚜蟲(chóng)傳播病毒的毒源較少;二是氣候的差異，2019年秋作遭遇連續(xù)40 d以上的高溫干旱天氣，干旱會(huì)加快病毒傳播媒介對(duì)病毒的傳播，高溫抑制植物生長(zhǎng)同時(shí)有利于蚜蟲(chóng)的活動(dòng)，減弱馬鈴薯自身的抗病性，冬作生長(zhǎng)季氣候冷涼，病毒媒介昆蟲(chóng)活動(dòng)減弱。

馬鈴薯病毒病的防治要從脫毒種薯的推廣入手，生產(chǎn)中以預(yù)防為主，通過(guò)減少蚜蟲(chóng)等傳毒媒介對(duì)病毒的傳播來(lái)減少病毒對(duì)馬鈴薯的危害。就湖南省目前情況，必須重視種薯的質(zhì)量，提高脫毒種薯的普及率，湖南馬鈴薯秋作播種時(shí)節(jié)由于北方種薯還未進(jìn)入收獲期，脫毒種薯引入受限，如果本地選擇適宜區(qū)域，運(yùn)用網(wǎng)棚進(jìn)行控制規(guī)模的良種繁育生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)秋作馬鈴薯種薯自供應(yīng)，可以有效改善湖南秋作脫毒種薯種源不足的現(xiàn)狀。

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收稿日期：2020 10 15修訂日期：2020 11 25

基金項(xiàng)目：

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0101905）;湖南省旱糧產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系育種與良種繁殖崗位科學(xué)家項(xiàng)目

* 通信作者

Email：qyuz@163.com