郝雅瓊 劉紅星 王澤華 聶興華 李伊然 陳旭 王維香 秦嶺 邢宇

摘要

栗疫病是一種嚴重危害栗屬植物的病害。為了明確栗疫病菌侵染板栗枝條的過程及侵染的關(guān)鍵時間點，本研究利用病理組織切片技術(shù)、顯微鏡和掃描電鏡技術(shù)對栗疫病菌侵染板栗枝條的過程進行了觀察。結(jié)果表明：接種栗疫病菌后0～5 h，菌絲先降解枝條表皮，進行橫向營養(yǎng)生長的同時沿著傷口縱向侵染，為進入皮層做準備;接種后6 h病菌開始在表皮定殖，并侵入皮層;接種后9 h在皮層可觀察到侵染性菌絲沿著細胞間隙向相鄰細胞延伸;接種后12 h栗疫病菌侵入韌皮部，在皮層的侵染面積擴大。隨著侵染程度加深，皮層、韌皮部等處細胞被菌絲降解，最終在形成層附近聚集。接菌后9 h為栗疫病菌侵染板栗枝條的關(guān)鍵時間點。

??關(guān)鍵詞

板栗枝條;栗疫病菌;侵染過程;顯微觀察

中圖分類號：

S436.64

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020526

Microscopic observation on infection process of chestnut branches by Cryphonectria parasitica

HAO Yaqiong，LIU Hongxing，WANG Zehua，NIE Xinghua，LI Yiran，CHEN Xu，WANG Weixiang，QIN Ling，XING Yu*

（College of Plant Science and Technology， Beijing University of Agriculture， Beijing102206， China）

Abstract

Chestnut blight is a disease that harms Castanea species seriously. In order to clarify the infection process of Cryphonectria parasitica in chestnut branches and the key time point of infection， the infection process of C.parasitica in chestnut branches were examined by pathological tissue section technology， microscope and scanning electron microscopy observations， respectively. The results showed that zero to five hours after inoculation， the hyphae first degraded the epidermal cells of the branches， and horizontally grew while infecting longitudinally along the wound to prepare for entering the cortex. Six hours after inoculation， C.parasitica colonized the epidermis and invaded into the cortex. Nine hours after inoculation， obvious infective hyphae can be observed in the cortex and extended along the intercellular space to adjacent cells. Twelve hours after inoculation， the pathogen infected the phloem， and the infection area of the cortex expanded. As the degree of infection deepened， cells in the cortex and phloem were degraded by hyphae， and eventually gathered near the cambium. Therefore， 9 h was determined to be the key time point of infection.

Key words

chestnut branch;Cryphonectria parasitica;infection process;microscopic observation

栗屬植物在中國的分布地域十分寬廣，在山東、河北、安徽、湖南、江西和福建等省份均有分布[1]。板栗Castanea mollissima Blume作為我國經(jīng)濟價值較高的鄉(xiāng)土經(jīng)濟林木，其起源可以追溯到8 700萬年以前[2]。板栗具有較高的食用與藥用價值，栗木也具有很高的實用性，板栗生產(chǎn)中會遭受很多病蟲害侵襲，其中栗疫病最為嚴重。

栗疫病是由栗疫病菌Cryphonectria parasitica （Murr.） Barr.寄生引起的一種嚴重危害栗樹的病害，為世界性的森林病害之一[3- 5]。栗疫病菌起源于東亞，通過感病的栗樹傳播到其他大陸[6]。歷史記錄和種群遺傳分析表明，栗疫病最初從日本本州島傳入北美[7]， 此后，從日本其他地區(qū)引進的板栗也相繼出現(xiàn)該病害，對北美的美洲栗影響十分嚴重。20世紀，栗疫病菌傳播到歐洲[8]。 目前栗疫病主要分布在亞洲、歐洲、北美洲。板栗雖然被認為對栗疫病具有抗性[9]，但在我國不少地區(qū)也出現(xiàn)了栗疫病，使其產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到了不同程度的危害[10 -11]。嫁接不久、生長環(huán)境貧瘠、易感病的品種容易感染栗疫病。在某些地區(qū)板栗疫病也會成片發(fā)生，導(dǎo)致樹死園毀[9，11]。

栗疫病菌屬于真菌界，子囊菌亞門，核菌綱，球殼目，間座殼科，隱叢殼屬[12]。 栗疫病的主要致病原是分生孢子，在條件適宜其生長時能反復(fù)侵染。栗疫病菌在秋季進入有性世代， 產(chǎn)生子囊，次年春季，子囊釋放子囊孢子。栗疫病屬于寄主主導(dǎo)性病害，病菌孢子從樹體受傷部位侵入，蟲傷、凍害、日灼、嫁接等造成的樹體創(chuàng)口，是病菌孢子侵染的主要途徑[13 -15]。

關(guān)于栗疫病菌的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征、分類地位、生物學特征、侵染過程、生物防治等方面國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量的研究工作[16- 21]。近些年，栗疫病菌EP155的基因組測序工作已經(jīng)完成[22]，栗疫病菌低毒性病毒Cryphonectria hypovirus 1（CHV1）已有3個不同菌株（CHV1EP713， CHV1Euro7和CHV1EP721）的基因組完成了測序并獲得了侵染性克隆[23]。中外學者的研究主要集中在栗疫菌與低毒病毒互作等方面[24- 28]。有關(guān)該病菌侵染過程的顯微觀察尚缺乏深入研究。為此，本研究通過病理組織切片法、顯微鏡和掃描電鏡觀察法對栗疫病菌侵染板栗枝條的過程進行觀察，旨在明確其侵染過程及侵染的關(guān)鍵時間點以及栗疫病菌侵染枝條過程中病菌與植物枝條互作的生物學過程，將為研究板栗疫病菌的致病機理提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

野生型栗疫病菌Cryphonectria parasitica菌株EP155保存于北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院，為野生型強毒力菌株，在PDA培養(yǎng)基上菌落為橘黃色。供試板栗來源于北京懷柔板栗試驗與推廣站的抗病品系野生板栗‘HBY1’，隨機采取粗度一致且無病蟲害的當年生營養(yǎng)枝條用于栗疫病菌的接種。

1.2試驗方法

1.2.1栗疫病菌菌絲及分生孢子的形態(tài)觀察

將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在28℃條件下恒溫光照培養(yǎng)3 d后，挑取少量菌絲制作玻片，在光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)特征。

1.2.2半薄切片

選取新鮮板栗樹枝條，用手術(shù)刀在枝條上劃出長5 mm的傷口，深度以到達形成層未到木質(zhì)部為準（約2 mm），將培養(yǎng)3 d的栗疫病菌菌絲塊接種于枝條的切口上。以接種空白PDA培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3次。接種后將枝條放在鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿里，吸水紙浸透無菌水使菌絲塊周圍保持較高濕度，于25～28℃，相對濕度60%～70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取樣時間分別為接種后5、6、7、8、9、10、11、12、24 h和48 h。

（1）取材固定取栗疫病菌侵染后的枝條，切取接種部位，將其切成厚0.5～1 mm的圓柱形小塊。 將材料放入固定液（70%叔丁醇 ∶40%甲醛 ∶丙酸 ∶丙三醇=17 ∶1 ∶1 ∶1）中，抽真空至離心管材料附近沒有氣泡且材料下沉到離心管底部，在4℃冰箱中保存2 d。

（2）清洗脫水用PBS（pH=7.4）緩沖液清洗3次，每次30 min;再用無菌水清洗2次，每次浸泡15 min。 在室溫下，用10%、30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水，每次30 min。

（3） 滲透包埋分別用不同濃度梯度的滲透溶液 [Solution A （Technovit 7100） ∶100%乙醇 =1 ∶3、 1 ∶1、3 ∶1]進行塑料滲透，每個梯度室溫浸泡12 h，最后浸于純Solution A中4℃冰箱過夜。將經(jīng)塑料滲透后的樣品轉(zhuǎn)移至模具底部，枝條縱切面緊貼模具面。立刻加入預(yù)冷的500 μL聚合液（Solution A ∶HardenerⅡ=15 ∶1）封存材料。用封口膜蓋住模具，室溫過夜聚合后切片。

（4）切片染色切取2 μm的薄片置于載玻片上，用0.05%甲苯胺藍溶液染色1 min，無菌水清洗4～5次，每次1 min，將染色后的切片常溫晾干后加2～3滴中性樹脂，置于通風櫥散發(fā)殘留的樹脂。在顯微鏡（BX51， Olympus， 日本）下觀察拍照。

1.2.3掃描電鏡觀察

取栗疫病菌侵染后的枝條，切取接種部位，將其切成厚0.5～1 mm的圓柱形小塊，參照張友玉等[29]的方法制備掃描電鏡樣品。將材料4℃固定2 d，用pH=7.4的PBS緩沖液沖洗5～6次，每次30 min，然后用10%、30%、50%、70%、90%、95%、100%乙醇依次脫水30 min，其中100%乙醇脫水2次，隨后用叔丁醇置換3次，每次30 min。將置換后的樣品浸泡在叔丁醇中， 20℃ 15 min。取出樣品置于冷凍干燥儀中至叔丁醇完全揮發(fā)。將樣品用導(dǎo)電膠粘于樣品臺，噴金后置于掃描電子顯微鏡（5136SB， TESCAN， 捷克）下觀察拍照。

2結(jié)果與分析

2.1栗疫病菌分生孢子和菌絲的形態(tài)特征

栗疫病菌菌絲無色，培養(yǎng)4 d后菌絲淡黃色、 橘黃色或無色，較密集，氣生菌絲少，菌絲直徑1.1～4.5 μm，分支與主支多呈直角。分生孢子器不規(guī)則，大小不一，淡黃至茶褐色;分生孢子單胞，無色，長橢圓形或圓柱形（圖1）。

2.2栗疫病菌對板栗枝條的侵染過程

2.2.1栗疫病菌對板栗枝條侵染途徑的光學顯微鏡觀察

接種后6 h栗疫病菌沿著傷口開始進行橫向營養(yǎng)生長，同時在傷口處定殖，準備侵入皮層。在接種部位可以觀察到菌絲，且表皮顏色加深至褐色。接種后9 h皮層細胞內(nèi)菌絲大量增殖，侵染范圍進一步擴大并開始接近韌皮部，可以觀察到接種處出現(xiàn)凹陷（圖2）。接種后12 h菌絲開始降解皮層細胞，且侵入韌皮部開始向形成層發(fā)展，此時可觀察到接種處表面有部分菌絲。接種24 h后，被栗疫病菌降解的皮層細胞與表皮分離，皮層細胞內(nèi)布滿大量菌絲，菌絲在形成層周圍分布，此時枝條接種處可見大量白色菌絲。

2.2.2栗疫病菌對板栗枝條侵染途徑的掃描電鏡觀察?

為進一步確認菌絲的侵染途徑，進行了掃描電鏡觀察。由圖3可以觀察到接種后6 h栗疫病菌主要是在表皮及傷口處的細胞定殖，為侵入皮層做準備，表皮已被菌絲降解。接菌9 h后可以看到栗疫病菌侵入皮層，皮層細胞中出現(xiàn)大量菌絲。菌絲主要在細胞交界處或細胞間隙延伸，伴隨著栗疫病菌的侵染在細胞內(nèi)產(chǎn)生了較多淀粉粒，此時部分細胞形態(tài)還較完整。接菌12 h后，大部分細胞皮層已被降解，此時觀察不到較完整的細胞。因此確定9 h為栗疫病菌侵染枝條的關(guān)鍵時間點，此時菌絲通過細胞的交界處侵染寄主細胞，而寄主則產(chǎn)生淀粉粒等相關(guān)物質(zhì)來抵抗。

3結(jié)論與討論

本研究通過顯微觀察的方法對栗疫病菌侵染板栗枝條的過程進行了觀察，發(fā)現(xiàn)栗疫病菌的侵染是一個動態(tài)變化的過程，接種栗疫病菌后0～5 h，菌絲先降解枝條表皮進行橫向營養(yǎng)生長，同時沿著傷口縱向擴展，為侵入皮層做準備;接種后6 h菌絲在表皮定殖并侵入皮層;接種后9 h，在皮層可以明顯觀察到侵染性菌絲沿著細胞間隙向相鄰細胞延伸，同時寄主細胞內(nèi)產(chǎn)生淀粉粒;接種后12 h可以觀察到栗疫病菌侵入韌皮部，在皮層的侵染面積擴大且細胞中充滿大量菌絲，隨著侵染程度加深，皮層、韌皮部等處細胞被菌絲降解，最終在形成層附近聚集。

在觀察栗疫病菌侵染板栗枝條的過程中，我們發(fā)現(xiàn)病原菌首先在傷口周圍的表皮擴展，尋找可以侵入細胞的機會，然而在栗疫病菌接種6 h后，我們只在傷口處的細胞中觀察到病菌菌絲的侵入。這與栗疫病菌主要從樹皮裂縫處或傷口侵染樹干，健康無傷口的栗樹基本不發(fā)病的研究結(jié)果一致[30]。其次，在侵染過程中菌絲最后停留在形成層，只在形成層形成緊密的扇形菌絲層，基本不進入木質(zhì)部。Hebard[31]利用組織學方法對潰瘍病菌的侵染過程進行了研究，發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)后，寄生菌形成菌絲扇的過程是潰瘍病形成和病斑面積擴大的關(guān)鍵。菌絲在板栗樹皮和形成層細胞間擴展，隨后菌絲扇內(nèi)菌絲增殖使菌絲扇頂端附近的部分寄主細胞壁破碎。 周而勛等[5]也發(fā)現(xiàn)栗疫病菌主要在皮層和形成層中蔓延， 當病害發(fā)生嚴重時， 木質(zhì)部表層亦可受害。由此我們推測橫向生長是為了更大面積地降解表皮，從而有利于病菌在植物組織中定殖。此外，我們觀察到，接種后9 h，栗疫病菌通過細胞間隙或細胞交界處在細胞間延伸，推測菌絲在細胞間的延伸主要是通過胞間連絲，并且病原菌會選擇細胞交界處等薄弱處擴展， 同時在菌絲附近產(chǎn)生了較多淀粉粒，阻礙了病菌菌絲在細胞內(nèi)的擴展，與菌絲相伴產(chǎn)生的淀粉粒是病原菌與寄主互作的結(jié)果。楊民和等[32]對稻瘟菌侵染的水稻葉片進行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表明，細胞內(nèi)的病菌菌絲周圍發(fā)生了寄主原生質(zhì)沉積，抑制細胞內(nèi)病菌菌絲的生長。本研究對栗疫病菌侵染板栗枝條的過程進行顯微觀察，明確了其侵染過程及侵染的關(guān)鍵時間點，揭示了板栗枝條的發(fā)病過程、壞死及崩解反應(yīng)，在細胞學水平上闡明了病菌與植物枝條互作機制，同時也為研究栗疫病菌致病機理和病害防治奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2020 -10- 09修訂日期：2020- 11- 27

基金項目：

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD1000605）;北京市屬高等學校創(chuàng)新團隊建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計劃（IDHT20180509）

* 通信作者

Email：xingyubua@163.com