張帥濤，李舉旭，李 滿，王衛(wèi)民，王 冬，常劍波，夏宗良，張小全*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市平安大道218號(hào) 450046

2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州市中山南路77號(hào) 310024

3.中國(guó)煙草總公司河南省公司，鄭州市商務(wù)外環(huán)路15號(hào) 450018

4.河南省煙草公司三門峽市公司，河南省三門峽市崤山路中段 472000

煙堿是影響煙葉品質(zhì)和卷煙質(zhì)量的重要成分［1］，烤煙煙堿含量高低受遺傳［2-3］、生態(tài)環(huán)境［4-5］、移栽期和施肥［6-8］等因素的影響。煙葉生產(chǎn)中通常遵循“少時(shí)富、老來貧”的烤煙氮素需求規(guī)律進(jìn)行施肥，以避免成熟期土壤中氮素過多，煙葉貪青晚熟，烤后煙葉煙堿含量偏高［9-11］。然而，近年來在我國(guó)部分煙區(qū)，煙葉生長(zhǎng)后期常遭遇持續(xù)低溫多雨天氣，煙葉采收推遲，出現(xiàn)了上部煙葉煙堿含量偏低，工業(yè)可用性下降等亟待解決的問題［7，12-13］。

研究表明，煙葉中煙堿累積量與根際氮素供應(yīng)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系［13］?？緹煷蝽敽?，煙株根系可持續(xù)吸收利用土壤中的氮素合成煙堿，但如果根際氮素缺乏，下部葉中的氮素會(huì)向根系遷移，并在根系中合成煙堿后由木質(zhì)部向上運(yùn)輸［14-15］。氮素遷移過程中氮素吸收和同化的關(guān)鍵酶硝酸還原酶（NR）和谷氨酸脫氫酶（GDH）以及氮素轉(zhuǎn)運(yùn)和再分配關(guān)鍵酶谷氨酰胺合成酶（GS）等發(fā)揮著重要作用［16］。此外，煙堿在煙株根部合成受NtPMT、NtQPT 等關(guān)鍵基因調(diào)控，在根部和葉片中的轉(zhuǎn)運(yùn)主要受NtNUP1、NtJAT1、NtJAT2等關(guān)鍵基因調(diào)控［17］。

2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide，EBR）是廣泛使用的一種人工合成的油菜素內(nèi)酯類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)控?zé)煵莸纳L(zhǎng)發(fā)育過程，可促進(jìn)煙草根系發(fā)育、提高光合效率、提高抗逆性等［18-26］。韓錦峰等［20-21］和齊群鋼等［22-23］通過盆栽和水培方式研究發(fā)現(xiàn)，EBR 可提高煙株的根系活力和葉片的光合能力，改善煙葉的化學(xué)成分；王麗君等［24］和許金亮等［25］分別發(fā)現(xiàn)外源EBR能改善煙苗對(duì)干旱和低溫的抗性；李健忠等［26］研究發(fā)現(xiàn)噴施EBR 可提高煙草葉片NR 和GS 活性，促進(jìn)葉片生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)氮代謝。然而，烤煙打頂后施用EBR對(duì)成熟期烤煙氮代謝、煙堿代謝以及烤后煙葉煙堿含量的影響卻鮮有報(bào)道。因此，通過大田試驗(yàn)，研究葉面噴施和灌根兩種施用方式下外源EBR 對(duì)烤煙成熟期葉片光合性能、干物質(zhì)積累、氮代謝相關(guān)酶活性、煙堿代謝相關(guān)基因表達(dá)量和烤后煙葉化學(xué)成分含量的影響，旨在為利用外源EBR 調(diào)節(jié)成熟期煙株氮代謝和煙堿代謝，提高煙葉煙堿含量等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)、材料與試劑

試驗(yàn)于2021年在河南省三門峽市靈寶市朱陽鎮(zhèn)梁家莊村（N110.41°，E34.19°）進(jìn)行。試驗(yàn)地前茬為煙草，土壤類型為黃壤土，土壤pH 7.65，土壤中有機(jī)質(zhì)含量為15.24 mg/kg、堿解氮含量為86.50 mg/kg、速效鉀含量為54.88 mg/kg、速效磷含量為15.36 mg/kg。試驗(yàn)田在起壟前撒施腐熟牛糞6 000 kg/hm2，移栽前穴施有機(jī)無機(jī)生物一體肥375 kg/hm2和硫酸鉀105 kg/hm2。

供試烤煙品種為云煙87。5月12 日移栽煙苗，移栽后第30 d，每株灌根10.00 g/L 發(fā)酵豆?jié){粉、20.00 g/L 有機(jī)無機(jī)生物一體肥、4.00 g/L 硫酸鉀、4.00 g/L硝酸鉀的混合水溶液0.50 L。

試驗(yàn)用EBR原液（0.1 g/L）由河北蘭升生物科技有限公司生產(chǎn)，葉面噴施EBR 溶液按照10 mL 原液兌水定容至5 L（濃度0.2 mg/L）的方法調(diào)配而成，灌根用EBR 溶液按照每10 mL 原液兌水定容至10 L（濃度0.1 mg·L-1）的方法調(diào)配而成。有機(jī)無機(jī)生物一體肥［有機(jī)質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）≥40%，mN∶mP2O5∶mK2O=10∶12∶18］由三門峽龍飛生物工程有限公司生產(chǎn)。發(fā)酵豆?jié){粉由三門峽鑫鼎農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)［27］。硫酸鉀由國(guó)投新疆羅布泊鉀鹽有限責(zé)任公司生產(chǎn)。硝酸鉀由山西金蘭化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置3個(gè)處理：CK對(duì)照處理為葉面噴施清水250 mL/株，同時(shí)清水灌根500 mL/株；T1 處理為葉面噴施0.2 mg/L EBR 溶液250 mL，同時(shí)清水灌根500 mL/株；T2 處理為葉面噴施清水250 mL/株，灌根0.1 mg/L EBR溶液500 mL/株。煙株第一朵中心花開放50%時(shí)（7月18日）統(tǒng)一打頂，單株留葉20片。在打頂當(dāng)天（移栽后第67 d）進(jìn)行外施EBR 處理。葉面噴施方法為用手動(dòng)噴霧器對(duì)單株葉面正反面均勻噴施，灌根方法為在壟上距煙株10.0 cm處用直徑5.0 cm的削尖木棍打1個(gè)深10.0 cm 的洞將溶液灌入。小區(qū)面積為60 m2，每小區(qū)植煙4 行共100 株，行株距120.0 cm×50.0 cm，田間3 次重復(fù)。其他田間管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)取樣

外施EBR 處理后第30 d，每處理選取具有代表性的6株煙，3株用于測(cè)量中部葉（第12葉位）和上部葉（第18葉位）的光合作用，并將對(duì)應(yīng)的中、上部葉用剪刀在其中部距主脈兩側(cè)2 cm 處取10 g 左右鮮葉片，迅速置于液氮中保存，用于相關(guān)酶活和基因表達(dá)分析。另外3 株用鐵鍬小心連根挖出，先剪取10 g左右的須根（用去離子水清洗干凈），置于液氮中保存，用于相關(guān)基因表達(dá)分析；再將根、莖、葉分開，稱重后放入烘箱中殺青，用于測(cè)定干物質(zhì)積累和殺青樣的總氮和煙堿。

煙葉烘烤后，每處理均選取烤后中部煙（C3F）和上部煙（B2F）各1.00 kg，用于常規(guī)化學(xué)成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

光合特性指標(biāo)測(cè)定：上午9：00～11：00使用光合測(cè)定儀（LI-6400，美國(guó)LI-COR公司）在自然光照條件下測(cè)定中部葉和上部葉的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率，設(shè)定光強(qiáng)為1 200 μmol/（m2·s），測(cè)定環(huán)境為開放式氣路。

酶活測(cè)定：鮮煙葉硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性采用Solarbio檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。

基因表達(dá)分析：調(diào)控氮素吸收的NtNR、氮素轉(zhuǎn)運(yùn)的NtGDH1、氨同化的NtGS2、氮素轉(zhuǎn)移和再利用的NtGS1-3 基因，調(diào)控?zé)焿A合成的NtQPT、NtPMT 和煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)的NtNUP1、NtJAT1、NtJAT2 基因的相對(duì)表達(dá)量均采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定，詳細(xì)測(cè)定方法和引物序列信息見文獻(xiàn)［28］，所有的樣品測(cè)定均重復(fù)3次，基因相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT方法進(jìn)行計(jì)算。

化學(xué)成分含量測(cè)定：葉片殺青樣總氮和煙堿含量以及烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量采用連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀（AA3，德國(guó)Seal公司）測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和繪圖，采用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Duncan法對(duì)不同處理進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR 對(duì)成熟期煙株光合能力和干物質(zhì)積累的影響

外源EBR 對(duì)成熟期煙株光合作用的影響見表1。由該表可見，各處理中部葉凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率與上部葉相比較低。與CK處理相比，T1 和T2 處理的煙株中部葉、上部葉的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均有顯著提高，且T1處理極顯著高于其他處理。T1 處理中、上部葉胞間CO2濃度顯著低于其他兩個(gè)處理，較CK 處理分別降低了6.61%和4.51%；T2處理中部葉的胞間CO2濃度顯著低于CK 處理，而上部葉胞間CO2濃度與CK 處理無顯著差異。說明外源EBR可提升成熟期煙株的光合能力，葉面噴施處理的效果好于灌根處理。

表1 外源EBR對(duì)成熟期煙株光合能力的影響①Tab.1 Effects of exogenous EBR on photosynthetic capacity of tobacco plants at mature stage

如表2所示，T1 處理單株干物質(zhì)積累總量顯著高于CK 和T2 處理，分別提高了35.65%、14.44%。T1處理根、莖、中部葉和上部葉的干物質(zhì)積累量均極顯著高于CK 處理。T1 處理莖、中部葉和上部葉的干物質(zhì)積累量顯著高于T2。T2 處理根、中部葉、上部葉和單株干物質(zhì)積累總量顯著高于CK 處理。說明外源EBR可增加成熟期煙株的干物質(zhì)積累量，T1處理對(duì)地上部的干物質(zhì)積累提升效果優(yōu)于T2處理。

表2 外源EBR對(duì)成熟期煙株干物質(zhì)積累量的影響Tab.2 Effects of exogenous EBR on dry matter accumulation of tobacco plants at mature stage(g·株-1)

2.2 外源EBR 對(duì)成熟期煙株不同部位總氮和煙堿含量的影響

外源EBR對(duì)成熟期煙株不同部位總氮和煙堿含量的影響見表3。T1和T2處理成熟期煙株根、莖、中部葉和上部葉中總氮含量均顯著高于CK 處理。T1處理成熟期煙株根、莖、中部葉和上部葉總氮含量較CK 處理分別提高了5.15%、14.63%、10.79%和14.97%；T2 處理較CK 處理分別提高了15.98%、11.59%、8.99%和10.20%。成熟期各處理不同部位煙堿含量呈現(xiàn)葉＞根＞莖的規(guī)律。在葉片中，各處理上部葉的煙堿含量相對(duì)較高。T1處理各部位煙堿含量最高，其中根、中部葉和上部葉中的煙堿含量較CK處理分別增加了37.84%、18.28%和41.25%，且與其他處理差異顯著。T2 處理中部葉、上部葉和根中的煙堿含量較CK處理分別提高了32.43%、9.68%和36.25%，達(dá)到顯著水平。T1和T2處理莖中的煙堿含量無差異，均顯著高于CK 處理。結(jié)果表明，外源EBR可顯著提高成熟期煙株葉片中的總氮和煙堿含量，并且效果受施用方式影響。

表3 外源EBR對(duì)成熟期煙株不同部位總氮和煙堿含量的影響Tab.3 Effects of exogenous EBR on total nitrogen and nicotine contents in different parts of tobacco plants at mature stage （%）

2.3 外源EBR 對(duì)成熟期葉片硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影響

外源EBR 對(duì)成熟期烤煙葉片硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性的影響如圖1所示。T1處理中部葉和上部葉的NR 活性相較CK 處理分別提高了30.21%和37.51%，達(dá)到極顯著水平。T2處理中部葉和上部葉NR 活性較CK 處理分別提高20.62%和24.97%，其中中部葉與CK 的差異達(dá)到顯著水平，上部葉與CK 的差異達(dá)到極顯著水平。T1處理中、上部葉GS 活性較CK 處理分別提高了106.77%、156.12%，且差異均達(dá)到極顯著水平。T2處理中部葉GS 活性與CK 處理無明顯差異，而上部葉GS 活性相比CK 處理提高了101.65%，差異達(dá)極顯著水平。說明外源EBR可以提高成熟期烤煙葉片硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性。

圖1 外源EBR對(duì)成熟期葉片硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig.1 Effects of exogenous EBR on activities of nitrate reductase and glutamine synthetase in tobacco leaves at mature stage

2.4 外源EBR 對(duì)成熟期煙株氮代謝和煙堿代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可見，T1 處理中部葉中調(diào)控氮代謝的NtNR、NtGDH1 和NtGS2 基因的相對(duì)表達(dá)量較CK 處理分別提高了2.27 倍、5.28 倍和1.24 倍，上部葉中3個(gè)基因的表達(dá)量較CK處理分別提高了4.32倍、3.76倍和6.63 倍，且都極顯著高于CK 和T2 處理。中部葉中NtGS2 基因相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)低于上部葉，說明隨著葉片成熟NtGS2基因相對(duì)表達(dá)量降低。T2處理中部葉、上部葉中NtNR 和NtGDH1 基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于CK處理，T2處理中部葉中NtGS2基因相對(duì)表達(dá)量與CK處理無顯著差異，而與上部葉的差異達(dá)到極顯著水平。因此，葉面噴施和灌根施入EBR 均可提高成熟期煙株葉片的氮素吸收、同化和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，其中葉面噴施更有利于成熟期煙株的氮素代謝。

中部葉調(diào)控氮素轉(zhuǎn)移和再利用基因NtGS1-3 的相對(duì)表達(dá)量與上部葉相比較高（圖2C），T1處理中部葉中NtGS1-3 基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于CK 處理，上部葉極顯著低于CK 和T2 處理；T2 處理中部葉中NtGS1-3 基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于CK 處理，上部葉極顯著低于CK 處理。因此，葉面噴施EBR 可影響成熟期葉片中氮素的轉(zhuǎn)移和再利用，有利于氮素的積累。

圖2 外源EBR對(duì)成熟期煙株氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of exogenous EBR on expression levels of nitrogen metabolism related genes of tobacco plants at mature stage

由圖3A 和圖3B 可知，煙堿合成基因NtQPT 在葉片和根中均有表達(dá)，且在根中的表達(dá)量高于葉片；中部葉、上部葉和根中的NtQPT 基因相對(duì)表達(dá)量在T1、T2 和CK 處理間的差異均達(dá)極顯著水平，且T1＞T2＞CK處理。未檢測(cè)到NtPMT在葉片中的表達(dá)，T1和T2 處理NtPMT 基因在根中的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于CK處理，T1和T2處理間差異不明顯。因此，外源EBR可提高煙株成熟期煙堿的合成能力。

圖3 外源EBR對(duì)成熟期煙株煙堿代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of exogenous EBR on expression levels of nicotine metabolism related genes of tobacco plants at mature stage

由圖3C、圖3D 和圖3E 可知，煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtNUP1 在根中相對(duì)表達(dá)量高于葉片，NtJAT1 和NtJAT2 在葉片中的表達(dá)量高于根中的表達(dá)量。T1處理葉片中NtNUP1 基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他兩個(gè)處理，T2 處理葉片中NtNUP1 基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于CK 處理。T1 和T2 處理根中NtNUP1基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于CK處理，說明外源EBR可使煙株根部合成的煙堿更多地運(yùn)輸至葉片中。T1和T2 處理根中NtJAT1 和NtJAT2 基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，但均極顯著高于CK 處理。中、上部葉NtJAT1 和NtJAT2 基因相對(duì)表達(dá)量在T1、T2 和CK處理間的差異均達(dá)極顯著水平，且T1＞T2＞CK處理。說明外源EBR 能有效提高煙堿在煙株中的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

2.5 外源EBR對(duì)烤后煙葉化學(xué)成分的影響

由表4可知，T1處理中、上部烤后煙葉中總氮含量較CK處理分別提高了6.59%、8.43%，煙堿含量較CK 處理分別提高了14.29%、16.74%，且均極顯著高于CK 處理。T2 處理中部葉總氮含量較CK 處理提高了4.19%，達(dá)到顯著水平，煙堿含量無明顯差異，上部葉總氮和煙堿含量顯著高于CK處理，較CK分別提高4.49%和8.14%。T1 和T2 處理中、上部葉總糖和還原糖含量均極顯著低于CK處理。T1和T2處理中部葉鉀含量無明顯差異，且均顯著高于CK 處理。T1處理上部葉鉀含量顯著高于T2和CK處理。說明外源EBR 可提高烤后煙葉總氮和煙堿含量，且葉面噴施EBR提高烤后煙葉煙堿含量的效果更顯著。

表4 外源EBR對(duì)烤后煙葉化學(xué)成分的影響Tab.4 Effects of exogenous EBR on key chemical components in cured tobacco leaves（%）

3 討論

在煙葉成熟期低溫多雨的河南省三門峽市靈寶煙區(qū)，烤煙打頂后通過葉面噴施或灌根的方式施用外源EBR 可提升成熟期煙株的光合能力，增加煙株各部位的干物質(zhì)積累量，提高葉片中的總氮和煙堿含量，顯著提升中部和上部烤后煙葉總氮和煙堿含量，這與韓錦峰等［20］和齊群鋼等［22-23］的研究結(jié)果一致。打頂后施用外源EBR可在不增加施氮量的情況下提高烤后煙葉的煙堿含量，除EBR 可調(diào)控烤煙成熟期的氮代謝外，這可能還與EBR 具有提高植物的低溫抗性［18，25］和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育［19，26］等作用有關(guān)，尚需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究中還發(fā)現(xiàn)葉面噴施EBR處理后煙株氮素的吸收同化、轉(zhuǎn)運(yùn)和保持能力均優(yōu)于灌根處理，這可能與本試驗(yàn)中等量的外源EBR 通過葉面噴施（T1）后煙株吸收更直接，吸收量更多，而灌根處理（T2）只有部分被根系吸收利用，導(dǎo)致T1和T2處理外源EBR 進(jìn)入煙株體內(nèi)的量不同有關(guān)。此外，T1 處理中部葉調(diào)控氮素轉(zhuǎn)移和再利用的關(guān)鍵基因NtGS1-3的相對(duì)表達(dá)量顯著低于CK處理，而T2處理則極顯著高于CK 處理（圖2C），說明兩種施用方式對(duì)中部葉氮素轉(zhuǎn)移能力的效應(yīng)不同。與CK 處理相比，T1 處理對(duì)烤后煙葉能起到降氯提鉀的作用（表4），這與李健忠等［26］和梁鑫等［29］的研究結(jié)果一致。T1處理上部葉中鉀含量顯著提高，這可能與T1處理煙株莖的干物質(zhì)積累量顯著提高（表2）且通過莖向葉片轉(zhuǎn)運(yùn)的鉀增多有關(guān)。

本研究中初步證實(shí)外源EBR可通過促進(jìn)煙株的生長(zhǎng)發(fā)育提高烤煙成熟期氮代謝和煙堿代謝水平，從而增加煙葉煙堿含量，但葉面噴施和灌根外源EBR 對(duì)煙株根系、葉片氮代謝和煙堿代謝影響差異的分子機(jī)理以及外源EBR對(duì)葉片衰老進(jìn)程的影響等還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

打頂后葉面噴施和灌根兩種EBR施用方式均可提升成熟期煙株的光合能力，增加煙株各部位的干物質(zhì)積累量，提高煙株的氮代謝及煙堿代謝水平，提高葉片中的總氮和煙堿含量，顯著提升中部和上部烤后煙葉煙堿含量。其中，葉面噴施處理可分別提高中、上部烤后煙葉煙堿含量14.29%和16.74%，效果優(yōu)于灌根處理。因此，可以通過葉面噴施0.2 mg/L EBR溶液的方法調(diào)節(jié)烤煙成熟期的氮代謝和煙堿代謝，提高上部煙葉煙堿含量。