田宇曦，劉曉艷，劉南茜，盧 亞，王月瑩，朱 鐳，邱一敏，閔 勇，陳 偉，陳 凌

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

粉虱（半翅目：粉虱科）是農(nóng)田和溫室的農(nóng)作物和園藝植物領(lǐng)域中最具破壞性的害蟲之一［1］。目前已確定有1 200多種粉虱科昆蟲分布在世界各地的許多國家，其中溫室白粉虱（Trialeurodesvaporiariorum）危害尤為嚴重［2］。其成蟲和若蟲階段都可以通過刺吸式口器從植物韌皮部取食植物汁液，導(dǎo)致植物活力下降，葉片過早枯萎、果實過早脫落和發(fā)育遲緩等［3］；此外，溫室白粉虱在取食過程中會分泌蜜露，從而引起煤污病，導(dǎo)致蔬菜等作物的可食用葉部和果實部位變色并降低其質(zhì)量［4］；同時，溫室白粉虱的取食過程為植物病毒提供了一種簡便的傳播途徑，例如毛形病毒（Crinivirus）和托拉多病毒（Torradovirus）在一系列寄主植物（包括甜菜、番茄、草莓等）中的傳播都可以通過溫室白粉虱作為媒介［5］。

目前防治溫室白粉虱的主要方法是針對其不同發(fā)育階段使用化學殺蟲劑［6］。然而，過量使用殺蟲劑導(dǎo)致了一系列的環(huán)境問題，包括對自然農(nóng)業(yè)環(huán)境中的非靶標生物的負面影響，破壞了害蟲與捕食者之間的生態(tài)平衡，對人類的健康風險和對環(huán)境的污染等。此外，溫室白粉虱具有快速產(chǎn)生殺蟲劑抗性的能力，有報道發(fā)現(xiàn)其易產(chǎn)生抗藥性的原因可能與其細胞色素P450的增強解毒作用相關(guān)［7］，這使得化學殺蟲劑防治溫室白粉虱的難度逐年加大。20世紀70年代中期開始，主要使用有機磷和擬除蟲菊酯類殺蟲劑防治溫室白粉虱，而到了20世紀90年代初已發(fā)現(xiàn)溫室白粉虱對這2種殺蟲劑普遍存在抗性，目前在一些地區(qū)也已發(fā)現(xiàn)對吡蟲啉、阿維菌素等多種新一代化學農(nóng)藥具有一定抗性的溫室白粉虱種群［8，9］。

由于新型殺蟲劑的研發(fā)成本較高、周期較長，利用已有的不同類型、不同作用靶標的殺蟲劑進行復(fù)配是一種既能有效防治溫室白粉虱，也是可以推遲害蟲抗藥性產(chǎn)生的有效方法［10］。新煙堿類殺蟲劑是一類重要的化學農(nóng)藥，自其上市以來很快成為增幅速率快、市場銷量大的殺蟲劑種類［11］，目前中國登記的新煙堿類殺蟲劑有12種，分別為吡蟲啉、噻蟲嗪、啶蟲脒、噻蟲胺、呋蟲胺、烯啶蟲胺、噻蟲啉、氟啶蟲胺腈、哌蟲啶、氯噻啉、環(huán)氧蟲啶和氟吡呋喃酮［12］。雙酰胺類殺蟲劑是繼新煙堿類殺蟲劑之后，廣受市場關(guān)注的一類殺蟲產(chǎn)品，現(xiàn)已登記上市的雙酰胺類殺蟲劑有9種，分別是氟苯蟲酰胺、氯氟氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺、四氯蟲酰胺、環(huán)溴蟲酰胺、四唑蟲酰胺、硫蟲酰胺和溴蟲氟苯雙酰胺［13］。新煙堿類和雙酰胺類殺蟲劑都是目前市面上流行的可以防治溫室白粉虱的2類重要產(chǎn)品，但隨著單劑的使用，已有部分溫室白粉虱種群對其產(chǎn)生了一定抗性［9］。

為了檢測新煙堿類和雙酰胺類殺蟲劑對溫室白粉虱是否具有聯(lián)合協(xié)同防效，從而增強二者的毒力，同時減緩溫室白粉虱的抗性產(chǎn)生，本研究將新煙堿類殺蟲劑啶蟲脒與雙酰胺類殺蟲劑溴氰蟲酰胺復(fù)配，通過共毒系數(shù)法和共毒因子法對其聯(lián)合毒力進行評價，以期為溫室白粉虱的田間有效化學防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 溫室白粉虱成蟲采集自湖北省武漢市東西湖區(qū)蔬菜大棚種植的番茄植株上，由湖北省生物農(nóng)藥工程中心在實驗室溫室中利用本氏煙草（Nicotianabenthamiana）植株作為宿主擴繁培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為25℃，濕度為60%，光周期明暗比為16 h∶8 h。隨機挑取初羽化的成蟲供試。

1.1.2 供試藥劑 6%啶蟲脒微乳劑，由河南勇冠喬迪農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)；10%溴氰蟲酰胺，由美國富美實公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 毒力測定 首先將啶蟲脒和溴氰蟲酰胺的藥品單劑分別用無菌水稀釋配制成梯度濃度的溶液，使其濃度分別為1 200、600、300、150 mg/L，再將2種殺蟲劑1∶1復(fù)配，用無菌水稀釋配制成相同梯度濃度的溶液，將2 mL的各藥液添加到6孔板中備用，以無菌水作為對照。

參考農(nóng)藥室內(nèi)對粉虱類害蟲活性生測標準的瓊脂保濕浸液法［14］并加以改進，取內(nèi)徑24 mm，內(nèi)高30 mm的單端開口亞克力管作為養(yǎng)蟲管，管內(nèi)加入3 mL的2%水瓊脂，利用打孔器在煙草葉上打孔以制備直徑為24 mm的葉碟，將葉碟浸入6孔板中的藥液中15 s后取出，自然晾干葉片。待水瓊脂冷卻后將葉碟背面向上貼到瓊脂上，確保葉碟完全覆蓋瓊脂，以避免溫室白粉虱接觸到瓊脂而影響白粉虱的存活。之后將裝有20～25頭溫室白粉虱成蟲的指形管打開，將溫室白粉虱輕輕驅(qū)趕到養(yǎng)蟲管中，后將養(yǎng)蟲管開口用黑色紗布包裹封閉，將養(yǎng)蟲管開口向下（溫室白粉虱習慣在葉背面定棲），倒置于光照培養(yǎng)箱中。光照培養(yǎng)箱溫度為25℃，濕度為60%，光周期明暗比為16 h∶8 h，24 h后統(tǒng)計各處理組中溫室白粉虱的死亡數(shù)，每個處理設(shè)置4組重復(fù)。

1.2.2 共毒因子和共毒系數(shù)的測定 根據(jù)Mansour等［15］提出的共毒因子法定性分析啶蟲脒和溴氰蟲酰胺1∶1復(fù)配的共毒效果。以300 mg/L復(fù)配藥劑的生測結(jié)果作為混劑觀察死亡率，利用之前單劑生測繪制出的回歸曲線，分別計算150 mg/L啶蟲脒和150 mg/L溴氰蟲酰胺所對應(yīng)的單劑理論死亡率a和b，進而得到300 mg/L復(fù)配藥劑的理論死亡率為（a+b），之后計算共毒因子，公式如下。

當共毒因子＞20時，認為2種單劑復(fù)配具有增效作用；當-20≤共毒因子≤20時，認為是相加作用；當共毒因子＜-20時，認為是拮抗作用。

根據(jù)孫云沛共毒系數(shù)法［16］定量分析2種殺蟲劑的共毒效果。根據(jù)單劑和復(fù)配藥劑的生測結(jié)果計算出毒力回歸方程，分別計算出啶蟲脒、溴氰蟲酰胺和二者1∶1復(fù)配藥劑的致死中濃度（LC50），分別計算相對毒力指數(shù)和共毒系數(shù)，計算公式如下。

當共毒系數(shù)＞120時，認為2種單劑復(fù)配具有增效作用；當80≤共毒系數(shù)≤120時，認為是相加作用；當共毒系數(shù)＜80時，認為是拮抗作用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計養(yǎng)蟲管中溫室白粉虱的死亡數(shù)和總蟲數(shù)，計算死亡率，利用Abbott’s公式計算校正死亡率。

利用Microsoft Excel 365軟件對數(shù)據(jù)進行記錄、計算，并采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，得出毒力回歸方程、致死中濃度及其95%置信區(qū)間等數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 啶蟲脒、溴氰蟲酰胺以及二者復(fù)配藥劑對溫室白粉虱的毒力測定

利用改良的瓊脂保濕浸液法，檢測了啶蟲脒和溴氰蟲酰胺單劑對溫室白粉虱的毒力，結(jié)果如圖1A、圖1B所示，在處理24 h后，啶蟲脒和溴氰蟲酰胺處理組中的溫室白粉虱的死亡率隨著藥劑濃度的增大而升高，表明這2種殺蟲劑對本研究擴繁的溫室白粉虱具有毒殺活性。之后將2種殺蟲劑按1∶1的比例復(fù)配后進行毒力測定，發(fā)現(xiàn)復(fù)配藥劑也同樣對溫室白粉虱具有毒殺活性（圖1C）。3種藥劑的毒力測定結(jié)果也同樣證明了本研究基于瓊脂保濕浸液法改良的生物測定方法行之有效。

圖1 啶蟲脒、溴氰蟲酰胺以及二者復(fù)配藥劑對溫室白粉虱的毒殺活性

2.2 共毒因子法分析啶蟲脒和溴氰蟲酰胺復(fù)配對溫室白粉虱的聯(lián)合毒力

啶蟲脒和溴氰蟲酰胺復(fù)配對溫室白粉虱的共毒因子測定結(jié)果如表1所示，以300 mg/L的復(fù)配藥劑為觀察對象，其中包括了150 mg/L的啶蟲脒和150 mg/L的溴氰蟲酰胺，根據(jù)之前單劑的毒力測定結(jié)果，采用SPSS20軟件繪制回歸曲線，將150 mg/L的濃度代入回歸曲線計算出啶蟲脒和溴氰蟲酰胺的單劑死亡率，分別為11.68%和20.81%，因此預(yù)期死亡率為二者相加的數(shù)值32.49%；而復(fù)配藥劑實際生物測定死亡率為45.15%，計算出共毒因子為38.97，表明啶蟲脒和溴氰蟲酰胺1∶1復(fù)配對溫室白粉虱具有協(xié)同增效作用。

表1 2種藥劑復(fù)配對溫室白粉虱成蟲的共毒因子

2.3 共毒系數(shù)法分析啶蟲脒和溴氰蟲酰胺復(fù)配對溫室白粉虱的聯(lián)合毒力

在共毒因子法分析的基礎(chǔ)上，進一步通過共毒系數(shù)法分析啶蟲脒和溴氰蟲酰胺復(fù)配對溫室白粉虱毒殺活性的增效作用。由表2可知，啶蟲脒和溴氰蟲酰胺單劑對溫室白粉虱的致死中濃度分別為813.94、650.51 mg/L，而二者1∶1復(fù)配藥劑對溫室白粉虱的LC50為380.33 mg/L，以啶蟲脒作為標準藥劑，計算出復(fù)配藥劑的理論毒力指數(shù)為112.56，而實測毒力指數(shù)為214.01，因此可以得出2種殺蟲劑復(fù)配的共毒系數(shù)為190.13，表明啶蟲脒和溴氰蟲酰胺1∶1復(fù)配對溫室白粉虱具有較強增效作用。

表2 兩種藥劑復(fù)配對溫室白粉虱成蟲的共毒系數(shù)

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，新煙堿類殺蟲劑啶蟲脒和雙酰胺類殺蟲劑溴氰蟲酰胺復(fù)配使用對溫室白粉虱具有較高的毒殺活性，通過共毒因子法和共毒系數(shù)法分析發(fā)現(xiàn)，二者具有協(xié)同增效作用。該結(jié)果將為溫室白粉虱的田間防治提供科學依據(jù)，有助于提高現(xiàn)有殺蟲劑防效，減少農(nóng)藥用量，同時延緩害蟲抗藥性的產(chǎn)生。

啶蟲脒和溴氰蟲酰胺二者復(fù)配對溫室白粉虱的協(xié)同增效毒力可能是由于這2類殺蟲劑毒殺昆蟲的作用機制不同所導(dǎo)致。新煙堿類殺蟲劑通過選擇性控制昆蟲的煙堿乙酰膽堿酯酶受體（nAChRs）來麻痹昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而導(dǎo)致昆蟲死亡［17］；而雙酰胺類殺蟲劑的作用機制根據(jù)化學結(jié)構(gòu)的不同主要分為2種類型，其中鄰苯二甲酰胺雙酰胺類殺蟲劑（如氟苯蟲酰胺）和鄰甲酰胺基苯甲酰胺（硫代）雙酰胺類殺蟲劑（如溴氰蟲酰胺）是通過激活昆蟲的魚尼丁受體來發(fā)揮殺蟲作用［18-20］，而間甲酰胺基苯甲酰胺雙酰胺類殺蟲劑（如溴蟲氟苯雙酰胺）是通過抑制昆蟲的γ-氨基丁酸受體來殺蟲的［21，22］。由于啶蟲脒和溴氰蟲酰胺毒殺溫室白粉虱的分子靶標和作用通路不同，因此二者共同作用時不存在競爭拮抗作用。本研究結(jié)果將為后續(xù)篩選更多用于防治溫室白粉虱的復(fù)配藥劑提供參考思路。

目前業(yè)界評估復(fù)配藥劑聯(lián)合毒力的方法主要有共毒因子法和共毒系數(shù)法2種。其中共毒系數(shù)法的本質(zhì)是以致死中濃度作為計算目標，以一種單劑作為標準藥劑，將其他單劑和復(fù)配藥劑的致死中濃度數(shù)值，也就是絕對毒力，轉(zhuǎn)換為同一參考系下的相對毒力，再根據(jù)復(fù)配比例計算出復(fù)配藥劑的理論毒力，并與實際測得的毒力進行比較；而共毒因子法則是直接用死亡率進行計算比較，當復(fù)配藥劑的實測死亡率＞期望死亡率＋期望死亡率×20%時，才認為復(fù)配藥劑具有顯著的增效作用。共毒系數(shù)法的計算中忽略了客觀存在的試驗誤差區(qū)間，在使用共毒系數(shù)判斷復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力時可能會出現(xiàn)偏差；而共毒因子法的計算中雖然考慮了誤差區(qū)間，但由于其只使用了一種濃度下的死亡率數(shù)據(jù)進行分析，其分析結(jié)果也存在一定的局限性。這2種方法各有利弊，將二者有機結(jié)合可以更準確地評價復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力［23］。本研究使用了2種方法評價了啶蟲脒和溴氰蟲酰胺的聯(lián)合毒力，明確了2種殺蟲劑復(fù)配對溫室白粉虱具有協(xié)同增效毒力。

在本研究中，只測定了啶蟲脒和溴氰蟲酰胺1∶1復(fù)配后對溫室白粉虱的活性，后續(xù)將測試更多的復(fù)配比例，從中篩選出二者復(fù)配使用的最佳比例，并在此基礎(chǔ)上開展田間藥效試驗，確定復(fù)配藥劑對溫室白粉虱的防效，從而切實地減少田間殺蟲劑的用量。同時，針對溫室白粉虱易產(chǎn)生抗藥性這一防治難點，還應(yīng)結(jié)合其他防治手段，如輪作、黃板物理誘殺［24］、釋放生物天敵麗蚜小蜂（Encarsiaformosa）［25］等，對溫室白粉虱開展綜合防治措施。