許文婷，薛玉滿，王 策，孔 瑩

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3. 成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 611130)

腦出血指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，是一種臨床常見的急性腦血管病，占每年全球腦卒中發(fā)生率的10%～15%[1]，該病具有較高的病死率和致殘率，給患者家庭及社會均帶來沉重的負擔。腦出血造成的局部腦組織缺氧缺血壞死和腦水腫等繼發(fā)性病理生理改變，是導致患者神經(jīng)功能缺損和死亡的重要原因[2]。同時，腦出血可誘導產(chǎn)生神經(jīng)炎癥反應，釋放白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)等多種炎性細胞因子，進一步加重腦組織損傷、壞死[3]。腦紅蛋白(Ngb)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達[4]，在缺氧、缺血條件下，腦組織中Ngb表達水平明顯增高，對神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有重要的保護作用[5]。針刺治療腦出血療效滿意且廣受歡迎，而不同頻率的電針刺可產(chǎn)生不同的針刺刺激量，進而不同程度地促進中樞神經(jīng)遞質(zhì)釋放，對治療效果有著直接影響[6-8]。本實驗擬通過觀察不同頻率電針刺對腦出血大鼠血腫腦組織中Ngb及NLRP3信號通路相關指標的影響，以探究電針刺治療腦出血的最佳頻率。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性健康Wistar大鼠90只，8周齡，體重(280±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(吉)-2018-0007。實驗環(huán)境：溫度(25±2)℃，濕度45%～70%，晝夜交替規(guī)律喂養(yǎng)，每8 h自動通風換氣1次。

1.2主要試劑 RIPA緩沖液(Sigma-aldrich公司)，TBST溶液(Sigma-aldrich公司)，鼠抗Ngb單克隆抗體(Abcam公司)，NLRP3(rat)ELISA Kit(Biovision公司)，Caspase-1(rat)ELISA Kit(Biovision公司)，IL-1β(rat)ELISA Kit(上海江萊生物科技有限公司)，IL-18(rat)ELISA Kit(上海江萊生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 Lab Standard腦立體定位儀(Stoelting公司)，HANS-100B電針治療儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)，F(xiàn)YL-YS-280L實驗室大鼠恒溫箱(FU.YI.LIAN公司)，Stuart SHM2勻漿器(Bibby-Stuart公司)，電泳儀(美國Bio-rad公司，型號：1658033)，Invitrogen iBright CL750 凝膠電泳智能成像系統(tǒng)(Thermo Scientific公司)，ELx808IU 酶標儀(BioTek公司)。

1.4實驗方法 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、假手術組、模型組、電針1組、電針2組、電針3組，每組15只。

1.4.1造模方法 參考文獻[9],模型組和電針各組以大鼠尾狀核自體動脈血注入法復制腦出血模型：以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，將其俯臥位固定于腦立體定位儀上，使大鼠頭部與術者相對，調(diào)整至耳間線平面比上門齒鉤平面高2.4 mm，使前后囟在相同平面上，固定后頭部正中備皮消毒，沿雙眼、雙耳中線交叉處縱向剪開約10.0 mm切口，手術鉗分離皮肉暴露顱骨，過氧化氫擦拭消毒后，以Bregma點為原點，在向后0.2 mm、向右旁開3.5 mm處，以牙科鉆鉆一直徑約1.0 mm的小孔，深度達骨膜。用微量注射器自大鼠尾動脈抽取適量自體動脈血，然后將微量注射器固定于定位儀上，沿鉆孔垂直向大鼠尾狀核內(nèi)緩慢進針，深度約為6 mm，以20 μL/min速度緩慢注入50 μL未加抗凝劑的自體動脈血，注射完畢后留針約3 min，緩慢拔針，以骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮，碘伏消毒以預防感染。術中均需保持無菌操作，待大鼠術后自然麻醉蘇醒后，歸籠飼養(yǎng)，以Bederson評分方法評判是否造模成功。正常組不進行造模，假手術組僅模擬手術創(chuàng)傷過程，不注入自體血。

1.4.2干預方法 參考《實驗針灸學》[10]中的大鼠穴位圖譜模擬人體經(jīng)穴定位，選取百會、水溝、雙側內(nèi)關穴，取毫針(華佗牌，0.25 mm×25 mm)，百會穴向前平刺5 mm，內(nèi)關穴向內(nèi)直刺5 mm；水溝穴以毫針(華佗牌，0.18 mm×15 mm)在大鼠鼻中隔下方向上斜刺2 mm。連接HANS-100B電針治療儀，采用疏密波，電流強度lmA，電針1組、電針2組和電針3組分別設定頻率為2 Hz、15 Hz和50 Hz，留針20 min。自造模后大鼠麻醉蘇醒后即給予第1次電針刺治療，此后每日1次，共連續(xù)治療10 d。正常組不給予干預；假手術組采用套疊式頓頭安慰針，底座固定于穴位處，手叩擊安慰針使皮膚感覺到針刺感，但不刺入皮膚，不連接電針治療儀。

1.5觀察指標及方法

1.5.1神經(jīng)行為學評分 分別于造模12 h、24 h、48 h、5 d、10 d時，參照Bederson評分[11]標準對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評分(剔除死亡大鼠，并按相應組別補齊數(shù)量)。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：懸尾試驗時，大鼠左側前肢攣縮，不能完全伸展或左側眼裂變??；2分：大鼠行走時向左側轉圈；3分：大鼠不能正常站立，向左側偏斜；4分：大鼠癱瘓，不能自發(fā)行走。

1.5.2腦組織形態(tài) 實驗結束后，將大鼠麻醉斷頭取腦，10%福爾馬林溶液固定，梯度酒精、二甲苯脫水，石蠟包埋、切片，HE染色后觀察腦組織病理學形態(tài)。

1.5.3血腫腦組織中Ngb表達情況 采用 Western blot法檢測：取大鼠腦組織置于冰上，分離出血腫腦組織(正常組和假手術組取右側尾狀核)，用PBS溶液清洗后，加入RIPA緩沖液，剪碎后轉移至勻漿器中，加足量 RIPA緩沖液，勻漿30 min，離心，上清液即為血腫腦組織裂解液?？捡R斯亮藍法測定總蛋白濃度，以RIPA緩沖液將各組蛋白濃度調(diào)至同一水平，-80 ℃保存。設定甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。取裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉移至PVDF膜上，以TBST反復漂洗3次后，加入5%的脫脂牛奶封閉孵育2 h，加入一抗(鼠抗Ngb單克隆抗體，濃度1∶1 000稀釋)，4 ℃恒溫孵育12 h。TBST反復漂洗3次后，加入二抗稀釋液，二氨基聯(lián)苯胺顯色后，采用凝膠電泳智能成像系統(tǒng)掃描、分析實驗結果，以Ngb/GAPDH比值表示Ngb的相對表達量。

1.5.4血腫腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量 取大鼠血腫腦組織，ELISA法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量，操作參照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1各組大鼠不同時間點神經(jīng)行為學評分比較正常組和假手術組神經(jīng)行為學評分均為0分；腦出血各組大鼠造模12 h時神經(jīng)行為學評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；造模24 h、48 h、5 d和10 d時，電針各組神經(jīng)行為學評分均明顯低于模型組(P均<0.05)，且隨著時間的延長和電針頻率的增加，評分呈明顯下降趨勢，但電針2組各時間點的神經(jīng)行為學評分和電針3組造模12 h、24 h、48 h時的神經(jīng)行為學評分與電針1組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，電針3組造模5 d和10 d時的神經(jīng)行為學評分均明顯低于電針1組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組腦出血大鼠造模不同時間點神經(jīng)行為學評分比較分)

2.2各組大鼠腦組織形態(tài) HE染色后，光鏡下見正常組和假手術組大鼠腦組織結構均正常，組織細胞排列整齊，胞漿充足，形態(tài)完整，少見變性壞死細胞；模型組大鼠在腦出血區(qū)域細胞排列明顯不規(guī)則，可見大量變性壞死神經(jīng)細胞，細胞間隙變大，胞漿減少，多數(shù)可見核固縮；電針1組腦出血區(qū)域略縮小，細胞排列仍紊亂，可見大量核固縮、變性壞死細胞；電針2組腦出血區(qū)域縮小，核固縮及變性壞死細胞相對減少；電針3組腦出血區(qū)域明顯縮小，細胞排列稍整齊，正常細胞數(shù)量增多，細胞間隙縮小，少見核固縮和變性壞死細胞。見圖1。

圖1 正常組、假手術組和腦出血各組大鼠腦組織形態(tài)(HE染色，×400)

2.3各組大鼠血腫腦組織中Ngb表達情況比較

假手術組血腫腦組織中Ngb表達量與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組和電針各組血腫腦組織中Ngb表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，電針2組和電針3組均明顯高于模型組(P均<0.05)，電針各組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2。

圖2 正常組、假手術組和腦出血各組大鼠血腫腦組織中腦紅蛋白表達情況

2.4各組大鼠血腫腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量比較 假手術組血腫腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量與正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組和電針各組血腫腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，電針各組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且隨著電針頻率的增加呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組、假手術組和腦出血各組大鼠血腫腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 含量比較

3 討 論

腦出血歸屬于中醫(yī)“中風”“偏枯”等范疇，主要表現(xiàn)為突然昏厥、半身不遂、偏身麻木、口眼斜、言語謇澀等，大多病勢危急[12]?！鹅`樞·刺節(jié)真邪》記載：“虛邪偏容于身半，其入深，內(nèi)居榮衛(wèi)，榮衛(wèi)稍衰，則真氣去，邪氣獨留，發(fā)為偏枯。”《東桓十書·溯洄集》中云：“中風者，非外來風邪，乃本氣自病也，凡人年愈四旬，氣衰之際，或因憂、喜、憤、怒傷其氣者，多有此病?！奔凑J為中風的發(fā)生與素體虛弱息息相關。近年來，中醫(yī)藥治療腦出血的效果得到了肯定，其中針刺在急性腦出血的治療中應用最為廣泛。電針刺是在針刺的基礎上加入生物電刺激，以加強對穴位神經(jīng)的滲透刺激作用，使療效更為顯著[13]。“病變在腦，首選督脈”，本研究采用電針刺百會穴、水溝穴和雙側內(nèi)關穴對腦出血模型大鼠進行干預治療，以醒腦開竅、通達脈絡。其中百會穴居于顛頂，是調(diào)節(jié)大腦功能之要穴，為各脈經(jīng)氣會聚之所，百脈之宗，貫達全身，具有熄風醒腦、升陽固脫、醒神志、蘇厥逆之功效[14]；水溝穴屬督脈，“總督諸陽，上至風府，入屬于腦”，是維護機體正氣，調(diào)節(jié)神志的重要穴位；內(nèi)關穴為手厥陰心包經(jīng)之要穴，是八脈交會穴之一，用于中風病氣滯血瘀、神志異常效果顯著[6]?，F(xiàn)代研究證實，針刺水溝穴具有保護腦神經(jīng)、擴張腦微血管、調(diào)節(jié)血壓和抗休克等作用[15]，針刺內(nèi)關穴有調(diào)節(jié)血壓、改善腦血流供應和認知功能的功效[6]。

頻率是電針刺的重要參數(shù)之一，不同頻率電針所引起的生物反應和產(chǎn)生的針刺效果不相同[13]。目前比較公認的電針頻率為低頻2～5 Hz、中頻15～30 Hz、高頻50～100 Hz，其中低頻刺激對于周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復效果較佳，而高頻刺激更適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復[16]。方程[17]研究發(fā)現(xiàn)，2 Hz、50 Hz、100 Hz頻率的電針均能夠改善腦缺血大鼠的學習記憶，其中50 Hz組的電針刺療效最為顯著。肖貽財?shù)萚18]發(fā)現(xiàn)，15 Hz、30 Hz頻率電針治療均可通過上調(diào)大腦缺血區(qū)域星型膠質(zhì)細胞的表達促進腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復。本實驗結果顯示，實驗過程中不同頻率電針組大鼠的神經(jīng)行為學評分均顯著低于模型組，且隨著時間和電針頻率的增加，評分呈明顯下降趨勢，同時大鼠腦出血區(qū)域的組織細胞形態(tài)改善；電針頻率50 Hz時，大鼠神經(jīng)行為學評分最低，腦出血區(qū)域的組織細胞形態(tài)改善最明顯。

Ngb是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類重要的特異性攜氧蛋白，主要于腦皮質(zhì)、丘腦和下丘腦表達，可參與神經(jīng)元的運氧和儲氧，與神經(jīng)元的存活密切相關[4]。Ngb對缺血缺氧非常敏感，其在缺血缺氧時可通過誘導HIF-1的表達而促進Ngb基因的轉錄，進而增強腦組織對游離氧的結合能力，促進結合氧的有效利用，對神經(jīng)系統(tǒng)起到重要保護作用[5]。NLRP3炎性小體是一類由病原體相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)聚集在一起的多蛋白復合物，由受體蛋白NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)組成[19]。NLRP3 炎性小體在免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有分布。近年來，NLRP3炎性小體被證實與腦出血、腦梗死、阿爾茨海默病、帕金森病和創(chuàng)傷性腦損傷等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關聯(lián)[20-21]。在神經(jīng)細胞受損時，NLRP3炎性小體及其下游銜接蛋白ASC均被激活，而活化的ASC又能募集Caspase-1形成NLRP3炎性復合體，促進 IL-1β和 IL-18 等多種炎性細胞因子的成熟和釋放，進而加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應和腦組織損傷[22]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，模型組和電針各組血腫腦組織中Ngb表達量和NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量均明顯高于正常組；電針各組血腫腦組織中Ngb表達量均明顯高于模型組，并隨著電針頻率的增加呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，而NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18含量均明顯低于模型組，且隨著電針頻率的增加呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。提示電針刺激可通過提高血腫腦組織中Ngb表達和調(diào)控NLRP3信號通路促進大鼠腦出血損傷的恢復。

綜上所述，不同頻率電針治療均可促進腦出血大鼠神經(jīng)損傷恢復，改善腦出血區(qū)域的組織細胞形態(tài)，其中50 Hz頻率電針刺激作用更佳，該治療作用可能是通過調(diào)控血腫腦組織Ngb表達及NLRP3信號通路實現(xiàn)的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。