莊麗華，孔營楠，楊爍慧，陸 方，龔志剛，詹松華，劉孟瀟

(1. 湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065；2. 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；3. 西門子醫(yī)療公司上海分部，上海 201318)

腦卒中又稱“中風”,是由于腦部血管突然破裂或血管阻塞導致大腦缺乏血液供應而引起腦組織損傷的一組疾病,主要包括出血性卒中和缺血性卒中，缺血性腦卒中發(fā)病率遠遠高于其他類型腦卒中。盡管腦卒中的預防和治療取得了一定進展，其全球病死率有所下降，但全球腦卒中帶來的負擔仍在增加[1-2]。缺血性腦卒中是由許多因素共同參與的極為復雜的病理過程，在其神經(jīng)損害過程中,二次損傷,尤其是二次損傷中缺血后炎性反應起著關(guān)鍵作用[3]。電針療法是在傳統(tǒng)針灸療法基礎上發(fā)展而來，可用于包括腦卒中在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[4-5]，其效果已得到充分肯定[6-9]。足三里穴、百會穴、太陽穴是臨床常用穴位，但針刺上述穴位能否改善小鼠腦缺血再灌注后炎性損傷缺乏系統(tǒng)研究。因此，本課題組借助磁共振等方法來評價電針對腦缺血再灌注小鼠炎性反應的影響，并探討其潛在機制，旨在為臨床電針治療腦缺血療效評價提供可能的新方法，為電針的臨床應用提供更為客觀的理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 野生型成年雄性C57BL/6N小鼠，體重20～25 g，SPF級，購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006和SCXK(浙)2018-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，飼養(yǎng)室溫度控制在20～26 ℃，溫差低于3 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2主要試劑及器材 磁共振儀，Magnetom skyra3.0T，德國西門子公司；3.0T8通道橫向放置老鼠線圈，上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司；小鼠MCAO線栓，北京西濃科技有限公司(beijing cinontech co.ltd)；低頻電子脈沖治療儀，G6805-2，上海醫(yī)用電子儀器廠；華佗牌針灸針，規(guī)格：0.25 mm×25 mm，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；小鼠酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，購自賽默飛世爾科技公司；定量聚合酶鏈反應(q-PCR)反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑，Roche公司；Western blot檢測相關(guān)抗體，Cell Signaling santa和 cruz公司；伊紅和蘇木素，美國Sigma公司；抗IBA1抗體，美國Abcam公司。

1.3分組、造模及干預方法 將小鼠按照體重隨機分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組24只。所有小鼠術(shù)前嚴格禁食12 h防止術(shù)后腸道梗阻，自由飲水，采用1%戊巴比妥鈉(35～40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，仰臥位固定后采用酒精棉球消毒皮膚，眼科剪剪開頸部正中皮膚1.0～1.5 cm，用眼科鑷頓性分離皮下組織及腺體，暴露頸動脈鞘。假手術(shù)組分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不插線栓。模型組和電針組采用改良的Longa線栓法制備模型：分離右側(cè)頸總動脈及頸外動脈，將頸總動脈近心端及頸外動脈結(jié)扎；將直徑(0.14±0.02)mm線栓放入27G注射器針頭(外徑0.4 mm、針長13 mm)，將針頭從頸總動脈插入，從針頭尾部推入線栓，鑷子夾住頸總動脈及其內(nèi)線栓，退出針頭后繼續(xù)將線栓插入頸內(nèi)動脈，遇到阻力時停止，這時線栓頭端距離頸總動脈分叉約1 cm，大腦中動脈起始處剛好被堵住。固定線栓，消毒切口并縫合，30 min后輕柔回抽尼龍栓線至頸總動脈分叉處(剛能看到線栓黑色標記)來實現(xiàn)再灌注。術(shù)中及術(shù)后保持室溫約25 ℃，采用白熾燈照射小鼠，使其術(shù)后直腸溫度保持在(37.0±0.5)℃，小鼠蘇醒后單籠飼養(yǎng)并記錄每只小鼠神經(jīng)功能得分(Longa 5分法)。實驗納入評分為1～3分(1分：垂直提尾時不能伸展對側(cè)前爪；2分：行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時身體向偏癱側(cè)傾倒)小鼠，剔除0分(無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀)、4分(不能自發(fā)行走,意識喪失)、5分(死亡)小鼠。若有小鼠在觀察時間點前死亡(磁共振掃描前麻醉不當、蛛網(wǎng)膜下腔出血、缺乏營養(yǎng)等因素)，則需要補充同廠家相似體重的小鼠，保證各組動物的樣本數(shù)量。電針組小鼠手術(shù)清醒后1 h開始進行電針干預：將小鼠俯臥位固定于特制固定器上，常規(guī)消毒，以32號0.5寸豪針于“百會穴”(小鼠頭頂右側(cè)兩耳根連線與前后中線交點處，圖1中GV20)30°角進針后，沿皮下15°角向右側(cè)“太陽穴”(外眼角與耳之間的凹陷中，圖1中EX-HN5)方向透刺刺入，另取一根毫針直刺患側(cè)足三里穴(小鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)腓骨小頭下3 mm處，圖1中ST36)約3.5 mm，進針后連接低頻脈沖治療儀，參數(shù)設置為低頻疏密波，5/20 Hz，脈沖寬度0.5 mA，頻率為100次/min。針刺期間每隔10 min強度增加1 V，共刺激30 min，每12 h電針1次。模型組和假手術(shù)組在每日電針組小鼠接受電針治療時給予同樣時間的捆綁。

圖1 小鼠百會、太陽、足三里穴示意圖

1.4觀察指標 每組分別于術(shù)后12 h、24 h、48 h、72 h各取6只小鼠進行以下指標觀察及檢測。

1.4.1神經(jīng)功能評分及腦水腫總體積百分比 各組小鼠在相應時間點采用Longa5分法進行神經(jīng)功能評分，然后采用前述方法麻醉小鼠后進行磁共振掃描，序列及具體參數(shù)見表1。 由于冠狀位圖像層數(shù)多于橫斷位，因此本研究使用冠狀位進行腦水腫總體積百分比計算。采用西門子后處理站計算每個層面T2WI圖像上高信號區(qū)像素點S1～Sn和每個層面總的像素點S1總～Sn總，小鼠腦水腫總體積百分比= 水腫體積/總體積=(S1+S2…+Sn)×T/[(S1總+S2總…+Sn總)×T]，T為層厚(1 mm)。

表1 小鼠磁共振掃描序列及參數(shù)

1.4.2血清炎性因子水平 小鼠MR掃描后立刻摘眼球取血，靜置30 min后以3 000 r/min離心(離心半徑8.5 cm)15～20 min， ELISA法測定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-1β(IL-1β)水平。

1.4.3腦組織HE染色及免疫組化染色 取血后立刻脫頸處死小鼠，取出完整腦組織，根據(jù)磁共振圖將梗死區(qū)域從冠狀位分成前后兩部分，取一半腦組織采用4%多聚甲醛固定24 h后進行HE染色、IBA1免疫組化染色。HE染色用于觀察神經(jīng)元壞死、間質(zhì)水腫、炎性浸潤情況，免疫組化圖片觀察小膠質(zhì)細胞活化情況。在病變側(cè)梗死中心取5個不重復的視野(400倍)，5個視野活化小膠質(zhì)細胞均值作為該小鼠活化小膠質(zhì)細胞數(shù)目。

1.4.4病灶側(cè)腦組織中TLR4 mRNA表達檢測取后半部分新鮮腦組織，采用q-PCR法測量病灶區(qū)TLR4 mRNA的相對表達量。具體步驟：將小鼠腦組織放入1 mL TRIzol溶液的勻漿管中，在勻漿機中勻漿后，吸取上清液體到新EP管中，加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，然后室溫靜置10 min，離心后吸取上層液體到另一個新EP管中。加入等體積異丙醇，上下輕輕顛倒15下，同樣方法靜置后再次離心10min。棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2次，4℃7 500 r/min離心5 min，室溫下風干30 min。沉淀用30μLDEPC水溶解得到RNA原液,加1μLRNA原液到微量核酸蛋白檢測儀上，記錄濃度值和260/280值。然后在離心管中加入RNA 2 μg、 Oligo dT 1 μL，用DEPC-ddH20補至13 μL，65 ℃ 10 min，然后在冰上迅速冷卻2min；在上述體系中再加入5×M-MLV Buffer 4 μL、PCR Nucleotide Mix 2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 0.5 μL，55 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min，-20 ℃長期保存。q-PCR(20 μL體系)兩步法反應：SYBR Premix Ex Taq(2×)10.0 μL、PCR Forward primer (2 μmol/L)1 μL、PCR Reverse primer(2 μmol/L)1 μL、DNA模板1.0 μL、DEPC-ddH2O 7 μL，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。引物序列：GADPH前向引物為5’-TCACCAGGGCTGCCATCTGCTCTC-3’，反向引物為5’-TTGCAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3’，序列長度129 bp；TLR4 mRNA前向引物為5’-CCTGATGACATTCCTTCTTCAACCA -3’，反向引物為5’-TGTAAGCCATGCCATGCCTTG -3’，序列長度161 bp。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析，熒光定量PCR結(jié)果采用Ct值(每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定區(qū)域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))表示，每組選取至少3個標本，每個樣本取3個復孔，并通過SPSS軟件計算出各段各基因表達的平均Ct值，結(jié)果經(jīng)內(nèi)參標化處理后，采用相對定量2-ΔΔCt法表示。

1.4.5病灶側(cè)腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測：取后半部分新鮮腦組織，置于1.5 mL EP管中，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，按照每20 μg組織加入100～150 μL裂解液的比例加入裂解液,于超聲儀中超聲3次，每次5 s，每次間隔9 s，再加入100～150 mL RIPA(含PMSF)，于冰上裂解1 h，每15 min震蕩1次，然后在4 ℃下14 000 r/min離心20 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-80 ℃保存,按照蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。根據(jù)BCA測得蛋白濃度，每支蛋白上樣20 μg，上樣體積20 μL。將蛋白液和5X變性緩沖液(16 μL+4 μL)混合,不足用RIPA補足至20 μL。于100 ℃加熱5 min后置于冰上，用于后期上樣。SDS-PAGE電泳：配制10%的分離膠和5%的濃縮膠。用1 mL加樣槍將制備好的膠液沿玻璃板中部緩慢加入到膠板玻璃板之間的空隙。分離膠灌至短板最高處1.5 cm停止灌膠，加入1 mL異丙醇封，于室溫下靜置1 h，使分離膠完全聚合后，棄掉異丙醇，并用濾紙吸干多余的異丙醇殘液。再灌濃縮膠灌滿后，將鯊魚齒的平端插入膠液下5 mm左右，室溫靜置1 h，使膠完全聚合后使用。兩端平行用力拔出梳齒，將變性好的蛋白液用微量移液器加入上樣梳齒內(nèi)。電壓60 V，40～60 min，120 V 2 h(溴酚藍到底)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠神經(jīng)功能評分比較 術(shù)后假手術(shù)組小鼠均無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，評分均為0分。模型組和電針組小鼠在造模后和磁共振掃描前均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損。電針組術(shù)后12 h神經(jīng)功能評分略高于模型組，術(shù)后24 h神經(jīng)功能評分略低于模型組，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；電針組術(shù)后48 h和72 h神經(jīng)功能評分均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 模型組和電針組腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)功能評分

2.2各組小鼠腦水腫總體積百分比比較 假手術(shù)組小鼠各個時間點腦組織T2WI圖像無明顯信號改變，模型組和電針組各個時間點T2WI圖像右側(cè)腦組織出現(xiàn)不同范圍高信號區(qū)域，見圖3。術(shù)后12 h、24 h、48 h，電針組腦水腫體積百分比略低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；術(shù)后72 h，電針組腦水腫體積百分比明顯低于模型組(P<0.05)，見表2。

圖3 假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷各組小鼠右側(cè)腦組織T2WI圖像

表2 模型組和電針組腦缺血再灌注損傷小鼠腦水腫總體積百分比比較

2.3各組小鼠HE染色表現(xiàn) 鏡下觀察，假手術(shù)組小鼠各個時間點兩側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列整齊，未見明顯壞死，細胞間隙致密，部分小鼠可見間質(zhì)輕度水腫，僅見少量炎性細胞浸潤；模型組小鼠在再灌注早期右側(cè)梗死部位即出現(xiàn)細胞壞死，細胞排列紊亂，皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)目減少，細胞間質(zhì)水腫明顯，可見大量炎性細胞浸潤，且隨著時間延長，逐漸加重，部分小鼠左側(cè)腦組織可見輕度水腫；電針組右側(cè)腦組織在術(shù)后12 h即出現(xiàn)不同程度的病理改變，至24～48 h最為嚴重，腦組織病理改變與模型組相當，術(shù)后72 h可見較少的神經(jīng)元細胞壞死，間質(zhì)水腫減輕，細胞排列欠規(guī)則，可見較少量炎性細胞浸潤。見圖4。

圖4 假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷各組小鼠腦組織HE染色情況(×400)

2.4各組小鼠IBA1免疫組化染色表現(xiàn) 鏡下觀察，假手術(shù)組各時間點均可見少量活化的小膠質(zhì)細胞和大量未活化的呈分支狀的小膠質(zhì)細胞。模型組術(shù)后12 h梗死邊緣出現(xiàn)大量活化的小膠質(zhì)細胞，術(shù)后24 h梗死邊緣小膠質(zhì)細胞數(shù)目略有減少，術(shù)后48 h、72 h在梗死中心可見大量活化小膠質(zhì)細胞。電針組術(shù)后12 h和24 h梗死邊緣可見大量活化的膠質(zhì)細胞，活化小膠質(zhì)細胞數(shù)目和模型組相當(P均>0.05)；術(shù)后48 h、72 h可見大量未活化的小膠質(zhì)細胞，活化小膠質(zhì)細胞數(shù)目明顯少于模型組(P均<0.05)。見圖5及圖6。

圖5 假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細胞免疫組化染色情況(×400)

圖6 假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷各組小鼠腦組織活化小膠質(zhì)細胞數(shù)目

2.5各組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較模型組和電針組術(shù)后各個時間點血清TNF-α和IL-1β水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；電針組術(shù)后12 h、24 h血清TNF-α和IL-1β水平與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，術(shù)后48 h、72 h均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表3。

表3 假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷各組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較

2.6各組小鼠腦組織中TLR4 mRNA相對表達量比較 模型組和電針組各個時間點TLR4 mRNA相對表達量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；電針組術(shù)后12 h、48 h TLR4 mRNA相對表達量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，術(shù)后24 h和72 h均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖7。

圖7 假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷各組小鼠腦組織中TLR4 mRNA相對表達量

2.7各組小鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量比較 模型組和電針組各個時間點TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；電針組術(shù)后48 h MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量和術(shù)后72 h TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖7及圖8。

圖8 假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷各組小鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量

3 討 論

以往關(guān)于電針治療腦缺血及再灌注損傷后炎性反應的相關(guān)研究多采用大鼠模型進行，對小鼠的研究較少，且研究時間范圍較大，沒有集中對缺血再灌注小鼠急性期進行較完整的研究[10-13]，加之目前迷你磁共振設備在科研機構(gòu)尚未普及應用，相關(guān)電針治療小動物腦缺血療效的研究很少利用到磁共振這種現(xiàn)代設備來對腦缺血后水腫進行直觀的顯示。故本次實驗一方面采用經(jīng)典的改良線栓法來造模，以減少剪刀剪切口帶來的出血，提高造模成功率，另一方面在實驗中借助臨床磁共振儀器掃描圖像取代常用的TTC染色，更為直觀和敏感。

電針是治療腦卒中的常用方法，足三里穴是足陽明胃經(jīng)的重要穴位，中醫(yī)理論認為腦卒中針刺治療應以陽明經(jīng)穴位為主，因此足三里穴為治療腦卒中的最重要穴位之一；百會穴是督脈之要穴，可調(diào)節(jié)記憶功能；太陽穴是人頭部的重要穴位，具有止痛醒腦的功效。故本研究選取上述穴位進行干預。實驗結(jié)果顯示，術(shù)后48 h和72 h，電針組神經(jīng)功能評分均明顯低于模型組；術(shù)后72 h，電針組腦水腫體積百分比明顯低于模型組，HE染色顯示神經(jīng)元受損程度明顯較模型組輕。說明早期針刺百會穴、太陽穴、足三里穴能改善腦卒中后神經(jīng)功能和腦水腫情況。

腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞及血液來源的單核巨噬細胞在卒中后炎性反應中扮演著重要角色[14]。卒中發(fā)生后，腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞迅速大量活化，活化的小膠質(zhì)細胞通常被作為神經(jīng)炎癥的標志[15]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，Toll樣受體(TLR)主要由小膠質(zhì)細胞表達[16]。TLR4是導致腦缺氧缺血及梗死后小膠質(zhì)細胞活化的必要因素，其在卒中后神經(jīng)損傷和炎性反應中具有重要作用。腦缺血后，TLR4主要介導MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導通路而產(chǎn)生下游炎性反應,缺血后腦組織損傷也主要由此通路來實現(xiàn)[17]。當TLR4受體接受刺激后，經(jīng)由細胞內(nèi)Myd88依賴性信號轉(zhuǎn)導通路，激活胞漿內(nèi)相關(guān)細胞因子，使得NF-κB被活化；活化后的NF-κB由胞漿進入胞核，啟動核內(nèi)相關(guān)基因并轉(zhuǎn)導出相應的mRNA，合成并釋放出TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等細胞因子，引起一系列炎癥反應[18-20]。本實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組也存在少量活化的小膠質(zhì)細胞，模型組和電針組術(shù)后12 h小膠質(zhì)細胞即有大量的活化，模型組一直持續(xù)到術(shù)后72 h，電針組術(shù)后72 h活化的小膠質(zhì)細胞明顯減少；模型組和電針組術(shù)后各時間點血清TNF-α、IL-1β水平及腦組織中TLR4 mRNA及TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相對表達量均較假手術(shù)組高，而電針組術(shù)后72 h均較模型組明顯降低。這說明電針可能通過抑制小膠質(zhì)細胞的活化，下調(diào)了TLR4mRNA的表達，進一步減少了MyD88、NF-κB的表達，從而抑制炎性因子TNF-α、IL-1β的釋放，起到減輕腦缺血炎性反應的作用。本研究也發(fā)現(xiàn)隨著腦缺血及缺血再灌注時間的延長,模型組TLR4mRNA及蛋白表達量與MyD88、NF-κB蛋白表達量變化的規(guī)律并不是完全一致，TLR4 mRNA在術(shù)后24 h才開始大量表達，而MyD88、NF-κBp65蛋白在術(shù)后12 h即達較高水平，這可能與腦組織內(nèi)還存在其他炎性受體有關(guān)，如TLR2、TLR9等也可能在缺血后被激活而導致NF-κB蛋白大量表達[21-22]。

綜上所述，電針百會、太陽、足三里穴可通過抑制小膠質(zhì)細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導通路，減少胞核NF-κB p65、MyD88蛋白的表達，抑制TNF-α、IL-1β的釋放，從而減輕腦缺血后炎癥反應,改善小鼠神經(jīng)功能，減輕腦組織水腫，進一步為電針治療腦卒中及其并發(fā)癥提供了客觀依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。