杜發(fā)強

河南省周口市人民醫(yī)院 466000

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸科常見疾病，在40歲以上人群中發(fā)病率約為8.2%，COPD易反復發(fā)作，根據病情可分為穩(wěn)定期和急性加重期[1]。COPD急性加重期并呼吸衰竭患者氣管、支氣管處于一種異常敏感的狀態(tài)，對刺激表現(xiàn)出過強、過早的收縮反應，易引發(fā)氣道高反應性[2]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)為單鏈、內源性、非編碼RNA，由21～25個核苷酸組成，參與細胞增殖、分化等多個生物學過程，具有十分重要的作用[3-4]。有相關研究表明[5]，微小核糖核酸-101(micro ribonucleic acid-101，miR-101)可抑制纖維細胞的增殖、活化，進而減輕肺纖維化。為了解血漿miR-101水平與COPD急性加重期并呼吸衰竭患者氣道反應性的關系，本研究通過分組研究分析，探討血漿miR-101水平與COPD急性加重期并呼吸衰竭患者氣道反應性的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月—2019年3月本院收治的186例COPD急性加重期并呼吸衰竭患者進行研究。186例患者中男113例，女73例，年齡45～78歲，平均年齡(58.63±8.27)歲，COPD病程3～10年，平均COPD病程(5.83±1.12)年，病程≤5年者98例，病程>5年者88例；呼吸衰竭分型：Ⅰ型56例，Ⅱ型130例；吸煙87例；氣道炎癥97例；肺功能損傷程度[6]：輕度44例，中度57例，重度52例，極重度33例。納入標準：符合COPD急性加重期診斷標準[7]，且為呼吸衰竭者；對本研究知情者。排除標準：嚴重心、肝、腎功能不全者；嚴重排痰障礙者；近期接受口腔、面部或頸部手術者；精神疾病或有認知障礙者。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集。使用抗凝采血管，采集所有研究對象外周靜脈血5ml，3 000r/min，離心5min，分離血漿，-80℃超低溫保存待測。

1.2.2 血漿miR-101表達水平測定方法。利用miRNA提取試劑盒(杭州諾揚生物技術有限公司)提取血漿miRNA，并檢測miRNA的質量和濃度，將miRNAs反轉錄為cDNA，miR-101及內參U6序列：miR-101上游引物為：5’-TACAGTACTGTTGATAACTGAA-3’，下游引物為5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6上游引物為：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’；下游引物為5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。反應體系為20μl：10μl 2×SYBR Mix，10×cDNA模板1μl，上下游引物各1μl，H2O 8μl，每樣品3個重復，反應程序：95℃預變性3min，95℃ 10s、60℃ 30s，72℃ 2min，35個循環(huán)，72℃延伸10min，在PCR儀上進行反應，以U6作為內參按照2-ΔΔCq法分析基因相對定量表達。

1.2.3 測定氣道高反應性方法。采用脈沖振蕩肺功能儀，連續(xù)測定10個自主呼吸波第1秒用力呼氣容積(FEV1)、共振頻率(Fres)、呼吸總阻抗(Z5)、總氣道阻力(R5)、中心氣道阻力(R20)等，以Z5增加39.90%、R5增加43.50%判斷存在氣道高反應性[8]。

1.2.4 影響氣道高反應發(fā)生因素的分析方法。歸納可能影響氣道高反應性的相關因素：主要包括性別、年齡、身體質量指數(shù)(BMI)、呼吸衰竭分型、吸煙、COPD病程、遺傳因素、呼吸道感染、氣道炎癥、肺功能損傷程度、血漿miR-101水平，將其作為自變量(X)，對其進行賦值，結果見表1；將氣道反應性作為因變量(Y)，氣道高發(fā)性記為1，氣道正常記為0，分析影響因素。

表1 影響氣道高反應性發(fā)生的自變量賦值結果

1.2.5 采用受試者工作特征曲線(ROC)，以脈沖振蕩肺功能測定結果為金標準，分析血漿miR-101對氣道高反應性的評估價值。

1.3 觀察指標 氣道高反應性發(fā)生情況及氣道高反應性組與氣道正常組血漿miR-101表達水平對比。對比氣道高反應性組和氣道正常組自變量構成比并進行Logistic回歸分析。血漿miR-101表達水平對是否發(fā)生氣道高反應性的評估效能。

1.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS23.0軟件分析所得數(shù)據，以n(%)描述計數(shù)資料，以χ2檢驗兩樣本間差異，以Logistic回歸分析探討影響因素，以秩和檢驗2組間等級分布的數(shù)據差異，采用ROC曲線分析血漿miR-101表達水平對氣道高反應性的評估效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氣道高反應性發(fā)生情況及氣道高反應性組與氣道正常組血漿miR-101表達水平對比 本研究186例COPD急性加重期并呼吸衰竭患者中有68例發(fā)生氣道高性，發(fā)生率為36.56%(68/186)；氣道高反應性組血漿miR-101水平明顯高于氣道正常組(P<0.05)，見表2。

表2 氣道高反應性組與氣道正常組血漿miR-101表達水平對比

2.2 血漿miR-101表達水平與氣道高反應性的關系 氣道高反應性組吸煙、COPD病程>5年、遺傳因素、呼吸道感染、氣道炎癥、血漿miR-101水平>1.0構成比均顯著高于氣道正常組(P<0.05)；2組患者肺功能損傷程度分布差異顯著(P<0.05)，氣道高反應性組肺功能重度損傷、肺功能極重度損傷構成比均顯著高于氣道正常組(P<0.05)；并經Logistic回歸分析可知，吸煙、COPD病程>5年、遺傳、呼吸道感染、氣道炎癥、肺功能重度損傷、肺功能極重度損傷、血漿miR-101>1.0均是影響氣道高反應性發(fā)生的獨立危險因素，見表3、表4。

表3 氣道高反應性組和氣道正常組自變量構成比對比[n(%)]

表4 Logistic回歸分析

2.3 血漿miR-101對氣道高反應性的評估價值 ROC分析顯示，血漿miR-101評估發(fā)生氣道高反應性的最佳截斷點為0.81，靈敏度為86.76%，特異度為73.73%，準確度為78.49%，曲線下面積(AUC)值為0.851。見圖1、表5。

表5 血漿miR-101對氣道高反應性的ROC分析

3 討論

氣道高反應性的發(fā)生與氣道炎癥、吸煙、氣道平滑肌及氣道表面滲透壓的改變等多種因素有關，會導致氣道縮窄、氣道阻力增加，進而引發(fā)胸悶、咳嗽、喘息等癥狀，COPD急性加重期并呼吸衰竭患者氣流受限嚴重，易引發(fā)氣道高反應性[9]。一些地區(qū)的醫(yī)院無法通過脈沖振蕩肺功能儀進行氣道高反應性檢測，此外缺乏方便、靈敏的早期檢測方法，多數(shù)患者確診較晚，嚴重影響了患者的治療、康復。有研究顯示miRNA的異常表達與肺組織纖維化、炎癥因子抑制等相關[10-11]，不同的miRNA在不同組織、細胞中發(fā)揮的作用不同，同一miRNA在不同疾病中的表達也不同。故而，探究miR-101表達水平與COPD急性加重期并呼吸衰竭患者氣道反應性的關系具有重要意義。

圖1 miR-101 ROC圖

miRNA由21～25個核苷酸組成，其異常表達與器官纖維化、腫瘤細胞的侵襲、遷移等有關[12]。隨著學者們對分子生物的深入探討，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)并進行了研究[13-15]，miR-101家族高度保守，在小鼠、豬及人類中均有發(fā)現(xiàn)，人類的miR-101a序列與小鼠完全相同，而miR-101b則就有1個核苷酸不同[16-18]。miR-101與肝臟、肺等器官纖維化、動脈粥樣化等多種疾病有關，能夠對多種基因的表達進行調節(jié)[19-20]，另外，miR-101還直接參與調節(jié)轉化生長因子-β(TGF-β)、囊性纖維跨膜調節(jié)因子(CFTR)等表達[21-22]。本研究中，有68例患者發(fā)生氣道高反應性，發(fā)生率為36.56%，氣道高反應性組血漿miR-101表達水平明顯高于氣道正常組，提示氣道高反應性患者血漿miR-101表達水平上調，呈高表達，發(fā)揮促使氣道反應性發(fā)生的作用，參與氣道高反應性的發(fā)生和發(fā)展。

本研究通過對血漿miR-101表達水平與氣道高反應性的關系進行探討，發(fā)現(xiàn)氣道高反應性的發(fā)生與吸煙、COPD病程>5年、遺傳、呼吸道感染、氣道炎癥、肺功能重度損傷、肺功能極重度損傷、血漿miR-101>1.0緊密相關，病程的增長、炎癥的加重、肺功能損傷的加重及血漿miR-101的高表達等，均會影響氣道高反應性的發(fā)生、發(fā)展，提示上述指標均是影響COPD急性加重期并呼吸衰竭患者發(fā)生氣道高反應性的獨立危險，需加強防控，逐一控制各項危險因素的不良影響，以達到降低COPD急性加重期并呼吸衰竭患者發(fā)生氣道高反應性的目的，減輕氣道高反應性對患者造成的危害。本研究還發(fā)現(xiàn)，ROC曲線分析顯示在血漿miR-101表達水平最佳截斷點為0.81，靈敏度為86.76%，特異度為73.73%，準確度為78.49%，AUC為0.851，說明血漿miR-101表達水平在評估氣道高反應性方面具有較高的臨床價值，可作為早期檢測指標。

綜上所述，血漿miR-101在氣道高反應性患者中呈高表達，且氣道高反應性的發(fā)生與患者吸煙、COPD病程>5年、遺傳、呼吸道感染、氣道炎癥、肺功能重度損傷、肺功能極重度損傷、血漿miR-101>1.0有關，血漿miR-101表達水平可作為COPD急性加重期并呼吸衰竭患者氣道高反應性的評估指標，其最佳截斷點為0.81。本研究僅對血漿miR-101在氣道反應性中的臨床意義進行初步探究，其具體的作用機制還需進一步深入研究。