金 曉 連 燁 王 鵬 馮三江

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）惡性程度非常高，即使采用手術(shù)輔助放化療等綜合治療，預(yù)后仍不理想[1]。GBM的發(fā)生、發(fā)展過程比較復(fù)雜，涉及多種基因的異常表達(dá)。研究顯示長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)控基因表達(dá)，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、增殖、凋亡、遷移等有關(guān)[2]。黃立寧等[3]報(bào)道lncRNA 重編程調(diào)節(jié)因子（lncRNA reprogramming regulator，lncRNA-ROR）在乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中，可通過不同路徑發(fā)揮促腫瘤或者抗腫瘤作用。本文探討人腦膠質(zhì)瘤lncRNAROR的表達(dá)變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理證實(shí)為GBM；年齡≥18歲；術(shù)前無(wú)放療、化療史；近3個(gè)月內(nèi)無(wú)激素類藥物、免疫抑制劑治療史；明確知曉研究?jī)?nèi)容，并簽署同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患其他惡性腫瘤；合并肝、腎等臟器功能不全；患心腦血管疾??；患血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾??；復(fù)發(fā)性GBM。

選取2015年6月至2019年6月手術(shù)切除的符合標(biāo)準(zhǔn)的GBM組織145例，其中男77例，女68例；年齡42～75 歲，平均（58.94±12.54）歲。取同期因顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)切除的非腫瘤腦組織56例為對(duì)照，其中男30例，女26例；年齡40～75歲，平均（56.46±13.95）歲。本研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 lncRNA-ROR 的檢測(cè) 采用qRT-PCR 法檢測(cè)ln?cRNA-ROR 的相對(duì)表達(dá)量。采用Trizol 法（美國(guó)Sig?ma公司）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（美國(guó)Sigma公司）。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物：lncRNA-ROR上游引物5'-GAAGGTTCAACATGGAAACTGG-3'，下游引 物5'-TGAGACCTGCTGATCCCATTC-3'；內(nèi)參GAPDH 上游引物 5'-CTCAGACAGGAT?GGGGAAGGTGA-3'，下游引物5'-ATGATCTT?GACCCTGTTGTCATA-3'。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、10 s變性；56 ℃、20 s退火；70 ℃、10 s延伸；循環(huán)45 次。采用2-△△CT法計(jì)算lncRNA-ROR相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)lncRNA-ROR平均表達(dá)水平分為高表達(dá)和低表達(dá)。

1.3 隨訪GBM 病人術(shù)后隨訪24 個(gè)月，采用門診方式進(jìn)行隨訪，記錄無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件分析；計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；利用多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析生存預(yù)后危險(xiǎn)因素；采用生存曲線分析lncRNA-ROR 表達(dá)水平與病人無(wú)進(jìn)展生存、總生存預(yù)后的關(guān)系；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBM 組織lncRNA-ROR 表達(dá)水平GBM 組織ln?cRNA-ROR 相對(duì)表達(dá)水平（1.54±0.38）明顯低于對(duì)照組（3.76±1.12；P<0.001）。

2.2 GBM 生存預(yù)后的影響因素 術(shù)后隨訪2 年，生存41例，死亡104例。單因素分析顯示腫瘤大小、腫瘤切除程度、術(shù)后放療、術(shù)后化療、lncRNA-ROR 表達(dá)水平與GBM 病人生存預(yù)后有關(guān)（P<0.05，表1）。多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，腫瘤全切除、術(shù)后放療、術(shù)后化療GBM病人生存預(yù)后的保護(hù)因素（P<0.05，表2），而lncRNA-ROR 低表達(dá)、腫瘤直徑≥5 cm是GBM病人生存預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05，表2）。

表1 本文病人生存預(yù)后影響因素的單因素分析

表2 本文病人生存預(yù)后影響因素的多因素Cox回歸分析

2.3 lncRNA-ROR 表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人生存預(yù)后的關(guān)系 生存曲線分析顯示，lncRNA-ROR高表達(dá)組GBM病人2年累積無(wú)進(jìn)展生存率（40.12%）與2年累積總生存率（48.56%）明顯高于低表達(dá)組（分別為16.25%、19.85%；P<0.05；圖1）。

圖1 生存曲線分析lncRNA-ROR表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人生存預(yù)后的關(guān)系

3 討論

GBM 是膠質(zhì)瘤中惡變程度最高的一種類型，具有侵襲性強(qiáng)、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)等特點(diǎn)，全切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后差[4]。GBM 的發(fā)生與多基因的調(diào)控作用有關(guān)[5]。研究表明lncRNA 與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)[6]。Li等[7]研究顯示lncRNA-ROR與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征有關(guān)，表明其異常表達(dá)參與腫瘤進(jìn)展。既往研究報(bào)道lncRNA-ROR在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出促腫瘤作用。李會(huì)儉等[8]發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌組織lncRNAROR 呈過表達(dá)，與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在關(guān)聯(lián)。吳立春等[9]則發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織、血清lncRNA-ROR 表達(dá)明顯增高，促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。本文結(jié)果顯示GBM組織lncRNA-ROR 表達(dá)明顯下調(diào)，提示lncRNA-ROR 過表達(dá)可能抑制GBM 發(fā)生、發(fā)展。Feng等[10]報(bào)道lncRNA-ROR 表達(dá)可通過對(duì)干細(xì)胞因子KLF4進(jìn)行靶向抑制，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的更新與增殖。

因惡性程度高、手術(shù)全切難度大等因素影響，GBM預(yù)后普遍欠佳[11]。本文結(jié)果顯示腫瘤切除程度以及術(shù)后放/化療與GBM 預(yù)后密切相關(guān)。這與既往研究報(bào)道一致[12]。本研究顯示lncRNA-ROR 低表達(dá)是GBM病人生存預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，生存曲線分析顯示lncRNA-ROR低表達(dá)組GBM病人2年累積無(wú)進(jìn)展生存率與2 年累積總生存率明顯降低。Li等[13]發(fā)現(xiàn)lncRNA-ROR 抑制mTORC2 關(guān)鍵成分Rictor 的表達(dá)，從而抑制Akt 信號(hào)通路。這提示lncRNA-ROR過表達(dá)能抑制Akt信號(hào)通路，從而抑制GBM細(xì)胞增殖。

綜上所述，GBM 組織lncRNA-ROR 呈低表達(dá)，與病人不良生存預(yù)后密切相關(guān)。這提示檢測(cè)lncRNA-ROR對(duì)GBM病人預(yù)后具有一定評(píng)估價(jià)值。