熊艷林 謝利娜 齊劉英

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，廣州 510405

牙周炎是發(fā)生在牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，發(fā)病率高，危害大［1］。牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周組織中最重要的細(xì)胞，能不斷形成新的纖維及牙骨質(zhì)，還可改建牙槽骨，對牙周組織的修復(fù)至關(guān)重要［2］。蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路是參與細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控的重要通路之一。目前研究表明，高血糖可通過影響AKT信號通路促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞凋亡，加重牙周組織炎癥反應(yīng)［3-4］。綠原酸具有消炎抗氧化，同時(shí)還有降糖等作用［5-6］。但綠原酸對高糖誘導(dǎo)的hPDLCs凋亡及AKT信號通路的影響罕見報(bào)道。本研究將探討綠原酸對高糖誘導(dǎo)的hPDLCs凋亡影響，并探究AKT信號通路在其中的作用，以期為綠原酸治療合并糖尿病的牙周炎患者提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

1、試劑

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購自大連美侖生物科技有限公司；DMEM低糖、高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司；D-葡萄糖和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；青鏈霉素購自美國康寧公司；RIPA裂解液購自杭州弗德生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；凋亡檢測試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；抗泛AKT抗體、抗磷酸化AKT（p-AKT）抗體、抗β-catenin抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購自美國CST公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司。

2、儀器

電泳儀及電泳儀/轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-Rad公司）；全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；全自動酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）；流式細(xì)胞儀（美國Bio-Rad公司）。

3、方法

3.1、牙周膜細(xì)胞培養(yǎng) 人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)采用組織塊法，具體方法已在前期文章中介紹［7］。簡述如下，取12～15歲青少年因正畸需要拔除的健康前磨牙，離體后用含青鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗3次后，取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成約1㎜×1㎜×1㎜的組織塊，鋪于25 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含20%FBS及青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基5 ml，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞長至80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.2、分組和人牙周膜細(xì)胞凋亡檢測 選擇第4代人牙周膜細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)參考文獻(xiàn)［6，8］，選擇2個(gè)葡萄糖濃度（正常葡萄糖5.5 mmol/L以及高葡萄糖25.0 mmol/L），綠原酸濃度選擇1 mg/ml（將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于DMSO中配制成100 mg/ml母液，使用前按所需濃度進(jìn)行稀釋），總共分為3組。對照組：5.5 mmol/L葡萄糖和0 mg/ml綠原酸；高糖組：25.0 mmol/L葡萄糖和0 mg/ml綠原酸；高糖+綠原酸組：25.0 mmol/L葡萄糖和1 mg/ml綠原酸。

將不同處理組的人牙周膜細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè) 細(xì)胞/ml，以1 ml/每孔加入6孔板，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在種板48 h后吸取舊培養(yǎng)基，加入PBS洗去殘留培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化細(xì)胞后，用4℃的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入100μl試劑盒緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μl FITC染料及2.5μl PI染料，混勻后避光、室溫放置15 min。額外加入400μl試劑盒緩沖液后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。

3.3、蛋白免疫印記法檢測各組人hPDLCs中AKT蛋白及p-AKT蛋白的表達(dá)情況 將不同處理組的人牙周膜細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)細(xì)胞/ml，以1 ml/每孔加入6孔板，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在種板48 h后吸取舊培養(yǎng)基，加入PBS洗去殘留培養(yǎng)基，加入200μl RIPA裂解液，4℃下振蕩30 min使細(xì)胞充分裂解，使用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行電泳分離后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜上蛋白1 h，分別加入抗泛AKT抗體（1∶1 000）、抗p-AKT抗體（1∶1 000）以及抗β-catenin抗體（1∶3 000），4℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶5 000），室溫孵育1 h，配置ECL發(fā)光液，使用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍攝和保存結(jié)果。目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-catenin灰度值。以上每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、綠原酸對高糖環(huán)境下hPDLCs凋亡的影響

對照組、高糖組以及高糖+綠原酸組細(xì)胞凋亡率分別為（6.66±0.18）%、（16.72±0.50）%、（11.32±0.17）%，與對照組相比，高糖組牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=32.789，P＜0.001），而當(dāng)在高糖中加入綠原酸后牙周膜細(xì)胞的凋亡率顯著降低（t=17.710，P＜0.001），具體見圖1。

圖1 綠原酸對高糖作用的人牙周膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響

2、綠原酸對高糖環(huán)境下hPDLCs中p-AKT、AKT蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，無論是高糖組或高糖+綠原酸組的牙周膜細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化，具體見圖2。而與對照組相比，高糖組的牙周膜細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低，而在高糖中加入綠原酸后，p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高，具體見圖3。

圖2 各組人牙周膜成纖維細(xì)胞中AKT蛋白表達(dá)情況

圖3 各組人牙周膜成纖維細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)情況

討 論

牙周組織由牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨及牙齦組成，起到支持、固定和營養(yǎng)牙齒的作用。hPDLCs是牙周組織中含量最多、功能最重要的細(xì)胞。hPDLCs可通過不斷合成和降解膠原纖維，維持牙周膜中纖維重建，并通過分泌多種細(xì)胞因子刺激成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，從而完成牙槽骨的修復(fù)和再生［9］。因此，hPDLCs是牙周組織修復(fù)的重要基礎(chǔ)。

糖尿病是一種全身性的代謝性疾病。已有研究表明，糖尿病與牙周病的關(guān)系密切［10］。有研究表明，糖尿病的高血糖狀態(tài)能調(diào)控hPDLCs中核因子κB受體活化因子配體的表達(dá)，促進(jìn)核因子κB的活化以及白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子等細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，增加牙周組織的炎癥反應(yīng)［11］。相關(guān)研究報(bào)道，晚期糖基化終末產(chǎn)物能通過誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生引起hPDLCs的凋亡及自噬［12］。本研究的結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖組hPDLCs的細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示高糖狀態(tài)對hPDLCs有明顯的損傷作用。AKT信號通路在腫瘤中研究較多，已發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移以及血管生成密切相關(guān)［13-14］。有文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸通過調(diào)控AKT信號通路，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)其凋亡［15］。在hPDLCs的研究中，高血糖能通過影響AKT信號通路促進(jìn)hPDLCs凋亡，加重牙周組織炎癥反應(yīng)［4］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖組牙周膜細(xì)胞的p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低，與之前的報(bào)道一致。

綠原酸是由肉桂酸酯化所形成的酚酸類化合物，是金銀花的主要有效成分［16-17］。在牙周病的防治中，已有多項(xiàng)研究表明綠原酸具有良好的抗炎作用。Tsou等［18］發(fā)現(xiàn)，綠原酸兼具抗菌活性及降低牙齦卟啉單胞菌蛋白酶活性的作用，對牙周疾病有很好的保護(hù)作用。余國璽等［6］發(fā)現(xiàn)，綠原酸能拮抗脂多糖對hPDLCs增殖的抑制作用，同時(shí)能促進(jìn)hPDLCs的成骨分化。但綠原酸對高糖誘導(dǎo)的hPDLCs凋亡及AKT信號通路的影響尚無報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在hPDLCs中，當(dāng)在高糖中加入綠原酸后，牙周膜細(xì)胞的凋亡率顯著降低，提示綠原酸能夠拮抗高糖對牙周膜細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。同時(shí)，當(dāng)在高糖中加入綠原酸后，牙周膜細(xì)胞的p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示綠原酸可拮抗高糖對牙周膜細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)水平的抑制作用。因此，我們推測綠原酸拮抗高糖誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用可能是通過激活A(yù)KT信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，綠原酸能通過激活A(yù)KT通路拮抗高糖對hPDLCs凋亡的促進(jìn)作用。本研究為綠原酸用于糖尿病牙周病患者的治療提供了一定的理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突