蘭國玉 湯守元 黃耿 朱鐘鐘 李新明 羅海平 姜進(jìn)平

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，黃石 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，黃石 435000

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的重要原因［1］。胃癌缺乏早期診斷和治療的標(biāo)志物，許多患者確診時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致胃癌患者的5年總生存率很低［2］。探究新的分子靶點(diǎn)對胃癌的診療具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類非蛋白編碼的單鏈小RNA，長度為19～25個(gè)核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)［3］。miRNA通過影響細(xì)胞的代謝、分化、增殖、侵襲等生物學(xué)過程，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要功能［4］。miR-4795-3p長度為22個(gè)核苷酸，其在疾病中的作用尚未見報(bào)道。本研究于2020年6月至12月探究miR-4795-3p對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及可能的調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

1、細(xì)胞株與主要試劑

胃癌細(xì)胞株BGC823購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；淋巴細(xì)胞增殖檢測（MTS）試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；陰性對照模擬物、miR-4795-3p模擬物、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）野生型（EGFR-WT）重組質(zhì)粒、EGFR突變型（EGFR-MT）重組質(zhì)粒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購于美國Invitrogen公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司；一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)志的二抗購于美國BD公司。

2、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

BGC823采用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，在6孔板接種對數(shù)生長期BGC823細(xì)胞，采用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物或miR-4795-3p模擬物，標(biāo)記為陰性對照組和miR-4795-3p組，12 h后更換培養(yǎng)基。

3、qRT-PCR檢測miR-4795-3p、EGFRmRNA表達(dá)情況

采用TRIzol法提取兩組對數(shù)生長期細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以U6為miR-4795-3p的內(nèi)參基因，以GAPDH為EGFR的內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-4795-3p、EGFR mRNA表達(dá)情況。EGFR正向引物：5’-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3’，反 向 引 物5’-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3’；U6正 向 引 物：5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反 向 引 物5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-4795-3p正向引物：5’-CAGAAGTGGCTAATAATA-3’，反向引物5’-CTTCATCAGCGTCAACAG-3’；GAPDH正 向 引 物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 引 物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

4、MTS法檢測BGC823細(xì)胞增殖情況

調(diào)整兩組BGC823細(xì)胞密度為6×103個(gè)/ml，以200μl/孔接種至96孔板，于第1、2、3、4天檢測BGC823細(xì)胞的增殖。加入20μl/孔MTS試劑，于培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測每孔于450 nm波長處吸光度（A450）值，繪制BGC823細(xì)胞生長曲線。

5、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測BGC823細(xì)胞侵襲能力

用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整兩組BGC823細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，以200μl/孔接種于Transwell上室，在下室加入600μl/孔含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，甲醇固定并采用結(jié)晶紫染色，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲數(shù)。

6、生物信息學(xué)軟件預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-4795-3p的靶基因

采用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-4795-3p的靶基因，EGFR可能是miR-4795-3p的靶基因。分別將EGFR-WT質(zhì)?；駿GFR-MT質(zhì)粒與陰性對照模擬物或miR-4795-3p模擬物共轉(zhuǎn)染至BGC823細(xì)胞，48 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測每孔BGC823細(xì)胞熒光素酶的相對活性。

7、蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測靶基因蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解液裂解BGC823細(xì)胞并提取總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜。室溫封閉后加入一抗，4℃孵育過夜。加入二抗，室溫孵育1 h，滴加ECL顯影液，采用凝膠成像儀曝光，觀察每組蛋白條帶。

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、各組BGC823細(xì)胞中miR-4795-3p的表達(dá)情況

陰性對照組和miR-4795-3p組BGC823細(xì)胞中miR-4795-3p的表達(dá)分別為（1.02±0.11）和（11.04±1.23），miR-4795-3p組是陰性對照組的10.82倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.14，P＜0.01）。

2、高表達(dá)miR-4795-3p對BGC823細(xì)胞增殖能力的影響

與陰性對照組相比，miR-4795-3p組BGC823細(xì)胞在第2、3、4天的A450值顯著下降（均P＜0.05），表明miR-4795-3p能夠抑制胃癌BGC823細(xì)胞增殖能力（圖1）。

圖1 高表達(dá)miR-4795-3p對BGC823細(xì)胞增殖能力的影響

3、高表達(dá)miR-4795-3p對BGC823細(xì)胞侵襲能力的影響

陰性對照組和miR-4795-3p組BGC823細(xì)胞細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（79.76±6.27）個(gè)和（31.38±5.46）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（t=5.82，P＜0.01），提示miR-4795-3p可抑制胃癌BGC823細(xì)胞的侵襲能力。

4、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-4795-3p的靶基因

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，陰性對照+EGFR-WT組和miR-4795-3p+EGFR-WT組BGC823細(xì)胞相對熒光素酶活性分別為（1.01±0.08）和（0.22±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.58，P＜0.01），提示miR-4795-3p可靶向結(jié)合EGFR。

5、高表達(dá)miR-4795-3p對EGFRmRNA表達(dá)水平的影響

陰性對照組和miR-4795-3p組BGC823細(xì)胞中EGFR mRNA的表達(dá)分別為（1.00±0.03）和（0.35±0.04），證實(shí)miR-4795-3p可直接下調(diào)EGFR mRNA的表達(dá)（t=14.08，P＜0.01）。

6、高表達(dá)miR-4795-3p對EGFR蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，與陰性對照組相比，miR-4795-3p組BGC823細(xì)胞EGFR蛋白減少，EGFR/MAPK信號通路蛋白如p-MEK、p-ERK表達(dá)降低（圖2）。

圖2 高表達(dá)miR-4795-3p對EGFR蛋白表達(dá)的影響

討 論

研究表明，miRNA由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體通過Dicer酶加工合成，其表達(dá)具有明顯的細(xì)胞特異性［5］。miRNA通過表現(xiàn)為癌基因或抑癌基因作用，其上調(diào)或下調(diào)與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［6］。miRNA如miR-665［5］、miR-129-5p［7］等通過負(fù)性調(diào)控癌基因的表達(dá)，抑制胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。miRNA如miR-301a-3p［8］、miR-223-5p［9］等通過下調(diào)抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。miR-4795-3p在胃癌細(xì)胞中的作用并不清楚。本研究表明，高表達(dá)miR-4795-3p可顯著抑制胃癌BGC823細(xì)胞的增殖和侵襲能力，miR-4795-3p在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因作用。

miRNA與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對，誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解或抑制蛋白合成，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)［6］。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，miR-4795-3p和EGFR mRNA存在互補(bǔ)配對的反應(yīng)元件。EGFR蛋白是一種糖蛋白，其在多種實(shí)體瘤中過表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及血管生成［10］。高表達(dá)的EGFR與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)，是食胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，EGFR參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程［11］。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-4795-3p可互補(bǔ)配對結(jié)合EGFR mRNA。本研究進(jìn)一步證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-4795-3p后細(xì)胞中EGFR表達(dá)下降，表明miR-4795-3p可靶向負(fù)調(diào)控EGFR的表達(dá)，EGFR是miR-4795-3p的靶基因。EGFR/MAPK信號通路的激活可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲［12］。本研究顯示，miR-4795-3p下調(diào)EGFR表達(dá)后，BGC823細(xì)胞中EGFR/MAPK信號通路蛋白如p-MEK、p-ERK表達(dá)降低，EGFR/MAPK信號通路被抑制。

綜上所述，miR-4795-3p能夠通過靶向負(fù)調(diào)控EGFR表達(dá)，干擾EGFR/MAPK信號通路，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，本研究為miRNA在胃癌的靶向治療研究提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突