萬淑瓊 鮑群麗 黃耿 姜艷萍 張青冬 王楚平

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）婦科，黃石 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）檢驗(yàn)科，黃石 435000；3鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）泌尿外科，黃石 435000

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，因其組織結(jié)構(gòu)較為隱蔽，卵巢癌早期的臨床特征并不明顯，大部分卵巢癌患者初診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅女性生命安全［1-2］。卵巢癌的臨床治療主要是手術(shù)治療，然而術(shù)后的高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者預(yù)后［3］。尋找早期的診斷標(biāo)志物及治療靶標(biāo)成為卵巢癌研究的重點(diǎn)。微小RNA（miR）是一類保守的單鏈RNA，屬于非編碼內(nèi)源性RNA，長度約為23個(gè)核苷酸［4-5］。miR通過在轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用［6-7］。已有大量研究顯示，miR作為調(diào)控因子參與卵巢癌細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡等功能［8-9］。2021年1月至5月，本研究擬探討miR-3529-3p對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制。

材料與方法

1、細(xì)胞與主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；NC mimic、miR-3529-3p mimic購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；CCK-8試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；結(jié)晶紫購于美國Sigma公司；Lipofectamine 3000、Opti-MEM培養(yǎng)基購于美國Life Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購于大連寶生物公司；一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于美國CST公司。

2、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將SKOV-3細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在24孔板內(nèi)接種處在對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞，采用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋miR試劑和Lipofectamine 3000試劑，充分混勻冰上孵育15 min，分別加預(yù)混液至24孔板。轉(zhuǎn)染NC mimic的SKOV-3細(xì)胞為NC組，轉(zhuǎn)染miR-3529-3p mimic的SKOV-3細(xì)胞為miR-3529-3p組。

3、qRT-PCR檢測miR-3529-3p、E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子3（E2F3）mRNA表達(dá)

采用TRIzol試劑收集細(xì)胞并提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒說明書分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR，引物序列如下，E2F3引物正向序列5’-TGACCCAATGGTAGGCACAT-3’，反 向 序 列5’-CATCTAGGACCACACCGACA-3’；miR-3529-3p引物正向序列5’-GTGGGGAGGGAAGGGTCATGCA-3’，反向序列5’-CTTCATCAGCGTCAACAG-3’。以U6為miR-3529-3p的內(nèi)參基因，以GAPDH為E2F3的內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-3529-3p、E2F3信使RNA（mRNA）的表達(dá)。

4、CCK-8法檢測SKOV-3細(xì)胞增殖情況

取兩組處于對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按2×103個(gè)/孔接種至96孔板，分別在第1、2、3、4天，每孔加入30μl CCK-8試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，使用酶標(biāo)儀檢測于450 nm處每孔的吸光度（A）值。每個(gè)樣本采用4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

5、集落形成實(shí)驗(yàn)檢測SKOV-3細(xì)胞增殖能力

取兩組處于對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按2×103個(gè)/孔接種至6孔板，連續(xù)培養(yǎng)10 d后，加入甲醇進(jìn)行固定，加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色，流水沖洗多余染液，計(jì)數(shù)集落形成數(shù)。每個(gè)樣本采用4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

6、生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-3529-3p的靶基因

采用miRNAMap數(shù)據(jù)庫（http：//mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/）預(yù)測miR-3529-3p的靶基因，E2F3可能是miR-3529-3p的靶基因。

7、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測靶基因蛋白的表達(dá)

采用細(xì)胞裂解液裂解SKOV-3細(xì)胞，提取總蛋白，在SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，采用硝酸纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。采用5%脫脂牛奶封閉，在一抗中孵育過夜，加入二抗并孵育2 h，均勻加入ECL顯影液，在凝膠成像儀中顯影、拍照。

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、各組SKOV-3細(xì)胞中miR-3529-3p的表達(dá)

SKOV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，NC組和miR-3529-3p組SKOV-3細(xì)胞中miR-3529-3p的表達(dá)分別為（1.01±0.07）和（9.55±1.50），miR-3529-3p組相比NC組上調(diào)了9.46倍（t=5.68，P＜0.01）。

2、miR-3529-3p對SKOV-3細(xì)胞增殖活性的影響

與NC組相比，miR-3529-3p組SKOV-3細(xì)胞在第2、3、4天時(shí)增殖活性均有下降趨勢（均P＜0.05），表明miR-3529-3p過表達(dá)抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖活性（圖1）。

圖1 高表達(dá)miR-3529-3p對SKOV-3細(xì)胞增殖能力的影響

3、miR-3529-3p對SKOV-3細(xì)胞集落形成能力的影響

NC組和miR-3529-3p組集落形成數(shù)分別為（120.50±18.38）個(gè)和（56.25±10.78）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.02，P＜0.01），提示miR-3529-3p過表達(dá)可抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的集落形成（圖2）。

圖2 miR-3529-3p對SKOV-3細(xì)胞集落形成的影響（結(jié)晶紫染色 ×10）

4、生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-3529-3p的靶基因

如圖3，采用miRNAMap數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-3529-3p的靶基因可能是E2F3。

圖3 miR-3529-3p與E2F3 mRNA的互補(bǔ)配對區(qū)域

5、miR-3529-3p對E2F3 mRNA表達(dá)的影響

NC組和miR-3529-3p組SKOV-3細(xì)胞中E2F3 mRNA的 表 達(dá) 分 別 為（1.03±0.14）和（0.27±0.05），表 明miR-3529-3p可抑制E2F3 mRNA的表達(dá)（t=5.60，P＜0.01）。

6、miR-3529-3p對E2F3蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，與NC組相比，miR-3529-3p組SKOV-3細(xì)胞E2F3蛋白減少，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4、CDK6表達(dá)降低（圖4）。

圖4 高表達(dá)miR-3529-3p對E2F3蛋白表達(dá)的影響

討 論

miR的異常表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)［10-11］。miR如miR-29c-3p［12］、miR-34a-5p［13］可通過干擾癌基因表達(dá)抑制卵巢癌的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療敏感性，產(chǎn)生抑癌作用。miR如miR-665［14］、miR-378a-3p［10］可通過干擾抑癌基因表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與患者的不良預(yù)后相關(guān)，表現(xiàn)為促癌作用。miR-3529-3p在卵巢癌細(xì)胞中的作用尚不明確。本研究顯示，過表達(dá)miR-3529-3p可顯著抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖活性，miR-3529-3p在卵巢癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌作用。

miRNA序列主要通過與對應(yīng)靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)不完全互補(bǔ)，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接誘導(dǎo)其降解，導(dǎo)致靶基因蛋白表達(dá)降低［12］。本研究采用miRNAMap數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-3529-3p和E2F3 mRNA存在互補(bǔ)反應(yīng)元件。E2F3蛋白屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員，通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞的增殖［15］。E2F3蛋白在膀胱癌、肝癌、胃癌等腫瘤中呈高表達(dá)，在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［16］。E2F3蛋白在卵巢癌癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，其表達(dá)水平伴隨臨床分期和腫瘤惡性程度發(fā)展而增高，沉默E2F3基因表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和順鉑耐藥性［15］。本研究顯示，過表達(dá)miR-3529-3p后SKOV-3細(xì)胞中E2F3基因的表達(dá)明顯降低，表明miR-3529-3p可靶向抑制E2F3的表達(dá)，E2F3可能是miR-3529-3p的靶基因。本研究顯示，miR-3529-3p抑制E2F3表達(dá)后，SKOV-3細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4、CDK6表達(dá)降低，間接提示細(xì)胞的增殖活性降低。

綜上所述，miR-3529-3p可能通過調(diào)控E2F3基因表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，提示miR-3529-3p可能成為卵巢癌靶向治療的分子靶點(diǎn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突