劉振 張磊 胡燦芳 羅國君 湯定中

上海市第六人民醫(yī)院金山分院神經(jīng)內(nèi)科，上海 201599

腦卒中屬于急性腦血管疾病，因腦部血管突發(fā)阻塞或破裂，造成腦組織損傷，分為缺血性卒中和出血性卒中，約70%的腦卒中為缺血性卒中，即腦梗死［1］?，F(xiàn)已知微小核糖核酸（miRNA）可調(diào)節(jié)靶基因表達，廣泛參與到細胞的增殖、分化、凋亡等過程中［2］。Xing等［3］研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中大鼠腦組織中存在微小RNA155（microRNA-155，miR-155）的高表達，推測miR-155與缺血性腦卒中關系密切。Notch信號通路在神經(jīng)發(fā)生過程中具有重要作用，該通路的激活可促進受損神經(jīng)元的修復［4］。Wang等［5］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155與Notch信號之間存在負向調(diào)節(jié)關系。天麻素提取于天麻根塊，已有研究表明其具有抗癲癇、改善腦供血不足、營養(yǎng)腦神經(jīng)等藥理作用［6］。為明確天麻素對腦卒中大鼠神經(jīng)是否具有保護作用，其中又是否涉及miR-155介導的Notch信號通路，2020年1月至2021年3月，本實驗建立缺血性腦卒中大鼠模型并進行探究，以期為腦卒中臨床治療新藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

資料與方法

1、材料

清潔級健康雄性SD大鼠94只，體質(zhì)量（250±10）g，在適宜環(huán)境中飼養(yǎng)，實驗過程嚴格遵循3R原則，經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院金山分院的醫(yī)學倫理委員會審核通過。斯貝福（北京）生物科技有限公司；天麻素注射液，廣東三才石岐制藥股份有限公司；Caspase-3、Caspase-9活性測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；細胞/組織miRNA提取試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；BCA快速蛋白定量試劑盒、兔抗大鼠Notch1抗體、兔抗大鼠Jagged1抗體、兔抗大鼠Hes1抗體、羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（HRP）抗體，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

2、方法

2.1、建立動物模型［7］大鼠術前12 h禁食、前4 h禁水，麻醉后于頸正中切口。分離左側(cè)頸總動脈，于近心端結(jié)扎；分離左側(cè)頸內(nèi)動脈，于遠心端動脈夾夾閉；分離左側(cè)頸外動脈，靠近分叉處結(jié)扎。左側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸內(nèi)動脈之間切口，頸內(nèi)動脈方向插入線栓，感受到阻力時取下動脈夾，當線栓不能繼續(xù)前進時，將其固定，縫合手術切口，整個過程持續(xù)照射恒溫燈，以保持大鼠體溫，防止術中大鼠體溫過低而亡。1 h后，同樣方式取出線栓。造模成功判斷：提尾時，大鼠右側(cè)肢體呈現(xiàn)屈曲狀態(tài)；活動時，大鼠身體傾倒或者轉(zhuǎn)圈；刺激時，大鼠右側(cè)肢體痛覺遲鈍甚至消失。

2.2、實驗分組 實驗分為假手術組、模型組、天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組，各18只。天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組：術后1 h通過腹腔注射，進行天麻素給藥［8］（低劑量50 mg/kg、中劑量100 mg/kg、高劑量150 mg/kg），1次/d，共3 d。假手術組：在手術中分離動脈，但不放置線栓、不結(jié)扎，術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。模型組：術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。

術后24 h，假手術組大鼠無死亡，模型組及天麻素低、中、高劑量組大鼠死亡1～3只不等，為保持各組實驗動物數(shù)量一致，每組隨機選取18只大鼠進行后續(xù)實驗。

2.3、評估大鼠神經(jīng)功能 Longa評分法：神經(jīng)功能無障礙，即正常，計0分；提尾時，右側(cè)肢體屈曲，即輕度受損，計1分；活動時，大鼠身體朝右側(cè)傾斜或轉(zhuǎn)圈，即中度受損，計2分；活動時，大鼠身體朝右側(cè)摔倒，即重度受損，計3分；大鼠無自發(fā)活動，計4分。

2.4、測定大鼠腦含水量 每組隨機選取5只大鼠，麻醉后取完整大腦，蒸餾水沖洗，濾紙擦干，電子精密天平稱重，記為m（濕）。腦組織置于恒溫干燥箱中烘干至恒重，再次稱重，記為m（干）。含水量=［m（濕）-m（干）］/m（濕）×100%。

2.5、2，3，5三苯基氯化四氮唑（TTC）染色觀察大鼠腦梗死情況 每組隨機選取5只大鼠，麻醉后取完整大腦，置于-20℃冰箱冷凍層冷凍20 min，以便切片。切片方向沿額級向后，厚度約2 mm，切下的腦組織立即浸入2%TTC染液中，避光37℃、20 min。數(shù)碼相機拍照后通過Image J系統(tǒng)分析結(jié)果。T為切片厚度，A為梗死面積，V為梗死體積。V=（A1+A2+A3+…+An）T，梗死率=V/腦組織總體積×100%。

2.6、蘇木素伊紅（HE）染色觀察海馬組織神經(jīng)元形態(tài)每組隨機選取3只大鼠，深度麻醉后進行4%多聚甲醛心臟灌注，取腦，固定，再經(jīng)75%乙醇脫水，進行石蠟包埋，5μm切片。梯度二甲苯、梯度乙醇處理后，HE染色，脫水透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

2.7、比色法測定Caspase-3和Caspase-9活性 每組隨機選取5只大鼠，麻醉，取完整大腦，冷凍后剪為組織碎片，充分研磨。取部分組織勻漿按照試劑盒說明書，進行Caspase-3和Caspase-9活性測定，Caspase活性以405 nm吸光度（A）值表示。

2.8、實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測miR-155表達 取2.7中組織勻漿，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于 RT-qPCR。miR-155正向引物：GGGTTAATGCTAATTGTG；反 向 引 物 ：AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC。內(nèi)參U6正向引物：GCTTCGGCACGTAACATATACTAAAAT；反向引物：CGCTTCACGACCTAGTGCGTGTCAT。2-ΔΔCt法分析實驗結(jié)果。

2.9、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測Notch1、Jagged1、Hes1表達取2.7中組織勻漿，4℃低溫15 000 r/min離心15 min，離心半徑12 cm，取上清定量蛋白。將50μg蛋白和上樣緩沖液混合均勻，10 min沸水浴，上樣并電泳。在將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶4℃封閉過夜，稀釋一抗（1∶1 000稀釋的Notch1抗體、Jagged1抗體、Hes1抗體）4℃過夜孵育；稀釋二抗（1∶1 000稀釋的羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1 h；顯色、成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析結(jié)果。

3、統(tǒng)計學方法

SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1、大鼠神經(jīng)功能評分

如表1所示，相較于假手術組，模型組和天麻素各劑量組評分顯著升高（均P＜0.05）；相較于模型組，天麻素低、中、高劑量組評分顯著降低（均P＜0.05），其中天麻素高劑量組最低。

表1 各組清潔級健康雄性SD大鼠神經(jīng)功能評分比較（±s，n=18）

表1 各組清潔級健康雄性SD大鼠神經(jīng)功能評分比較（±s，n=18）

注：天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組術后1 h通過腹腔注射，進行天麻素給藥（低劑量50 mg/kg、中劑量100 mg/kg、高劑量150 mg/kg），1次/d，共3 d；假手術組在手術中分離動脈，但不放置線栓、不結(jié)扎，術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d；模型組術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。相較于假手術組，a P＜0.05；相較于模型組，b P＜0.05

組別假手術組模型組天麻素低劑量組天麻素中劑量組天麻素高劑量組F值P值神經(jīng)功能評分0 3.52±0.31a 2.64±0.28ab 2.03±0.33ab 1.55±0.34ab 389.655＜0.001

2、大鼠腦含水量

如表2所示，相較于假手術組，模型組和天麻素各劑量組大鼠腦組織含水量顯著升高（均P＜0.05）；相較于模型組，天麻素低、中、高劑量組大鼠腦組織含水量顯著降低（均P＜0.05），其中天麻素高劑量組最低。

表2 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織含水量比較（±s，n=5）

表2 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織含水量比較（±s，n=5）

注：天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組術后1 h通過腹腔注射，進行天麻素給藥（低劑量50 mg/kg、中劑量100 mg/kg、高劑量150 mg/kg），1次/d，共3 d；假手術組在手術中分離動脈，但不放置線栓、不結(jié)扎，術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d；模型組術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。相較于假手術組，a P＜0.05；相較于模型組，b P＜0.05

組別假手術組模型組天麻素低劑量組天麻素中劑量組天麻素高劑量組F值P值腦組織含水量（%）71.31±2.22 87.44±2.56a 81.52±2.19ab 80.39±2.24ab 79.33±2.05ab 32.791＜0.001

3、大鼠腦梗死情況

如表3、圖1所示，可觀察到染色的切片組織呈現(xiàn)紅白相間，白色部分即為梗死組織。相較于假手術組，模型組和天麻素各劑量組大鼠腦梗死率顯著升高（均P＜0.05）；相較于模型組，天麻素低、中、高劑量組大鼠腦梗死率顯著降低（均P＜0.05），其中天麻素高劑量組最低。

圖1 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦梗死情況（2，3，5三苯基氯化四氮唑染色）；A為假手術組，B為模型組，C為天麻素低劑量組，D為天麻素中劑量組，E為天麻素高劑量組

表3 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦梗死比較（%，±s，n=5）

表3 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦梗死比較（%，±s，n=5）

注：天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組術后1 h通過腹腔注射，進行天麻素給藥（低劑量50 mg/kg、中劑量100 mg/kg、高劑量150 mg/kg），1次/d，共3 d；假手術組在手術中分離動脈，但不放置線栓、不結(jié)扎，術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d；模型組術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。相較于假手術組，a P＜0.05；相較于模型組，b P＜0.05

組別假手術組模型組天麻素低劑量組天麻素中劑量組天麻素高劑量組F值P值腦梗死率0 32.15±3.59a 24.66±2.35ab 20.87±2.06ab 15.65±1.54ab 144.880＜0.001

4、大鼠神經(jīng)元形態(tài)變化

如圖2所示，假手術組大鼠海馬CA1區(qū)可觀察到錐體神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，排列緊密，細胞核圓潤，染色清楚；模型組大鼠海馬CA1區(qū)則觀察到神經(jīng)元細胞數(shù)目大量減少，細胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則，輪廓模糊，排列松散，細胞核固縮；天麻素各劑量組大鼠海馬CA1區(qū)可觀察到神經(jīng)元細胞數(shù)目較模型組有所增加，細胞排列相對緊密，邊界較為清晰。

圖2 各組清潔級健康雄性SD大鼠神經(jīng)元形態(tài)（蘇木素伊紅染色 ×200）；A為假手術組，B為模型組，C為天麻素低劑量組，D為天麻素中劑量組，E為天麻素高劑量組

5、大鼠腦組織中Caspase-3和Caspase-9活性

如表4所示，相較于假手術組，模型組和天麻素各劑量組大鼠腦組織中Caspase-3和Caspase-9活性顯著升高（均P＜0.05）；相較于模型組，天麻素低、中、高劑量組大鼠腦組織中Caspase-3和Caspase-9活性顯著降低（均P＜0.05），其中天麻素高劑量組最低。

表4 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織中Caspase-3和Caspase-9活性比較（±s，n=5）

表4 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織中Caspase-3和Caspase-9活性比較（±s，n=5）

注：天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組術后1 h通過腹腔注射，進行天麻素給藥（低劑量50 mg/kg、中劑量100 mg/kg、高劑量150 mg/kg），1次/d，共3 d；假手術組在手術中分離動脈，但不放置線栓、不結(jié)扎，術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d；模型組術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。相較于假手術組，a P＜0.05；相較于模型組，b P＜0.05

組別假手術組模型組天麻素低劑量組天麻素中劑量組天麻素高劑量組F值P值Caspase-3 0.43±0.04 3.27±0.42a 2.48±0.31ab 2.12±0.27ab 1.43±0.21ab 74.036＜0.001 Caspase-9 0.37±0.04 2.79±0.36a 2.05±0.25ab 1.76±0.20ab 1.23±0.16ab 79.203＜0.001

6、大鼠腦組織中miR-155的表達

如表5所示，相較于假手術組，模型組和天麻素各劑量組大鼠腦組織中miR-155表達顯著升高（均P＜0.05）；相較于模型組，天麻素低、中、高劑量組大鼠腦組織中miR-155表達顯著降低（均P＜0.05），其中天麻素高劑量組最低。

表5 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織中微小RNA155的表達比較（±s，n=5）

表5 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織中微小RNA155的表達比較（±s，n=5）

注：天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組術后1 h通過腹腔注射，進行天麻素給藥（低劑量50 mg/kg、中劑量100 mg/kg、高劑量150 mg/kg），1次/d，共3 d；假手術組在手術中分離動脈，但不放置線栓、不結(jié)扎，術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d；模型組術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。相較于假手術組，a P＜0.05；相較于模型組，b P＜0.05

組別假手術組模型組天麻素低劑量組天麻素中劑量組天麻素高劑量組F值P值微小RNA155 1.00±0.00 2.64±0.27a 2.15±0.18ab 1.97±0.16ab 1.63±0.15ab 60.930＜0.001

7、大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、Hes1的表達

如表6、圖3所示，相較于假手術組，模型組大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、Hes1表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），天麻素各劑量組Notch1、Jagged1、Hes1表達顯著升高（均P＜0.05）；相較于模型組，天麻素低、中、高劑量組大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、Hes1表達顯著升高（均P＜0.05），其中天麻素高劑量組最高。

圖3 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、Hes1的表達；A為假手術組，B為模型組，C為天麻素低劑量組，D為天麻素中劑量組，E為天麻素高劑量組

表6 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、Hes1的表達比較（±s，n=5）

表6 各組清潔級健康雄性SD大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、Hes1的表達比較（±s，n=5）

注：天麻素低劑量組、天麻素中劑量組、天麻素高劑量組術后1 h通過腹腔注射，進行天麻素給藥（低劑量50 mg/kg、中劑量100 mg/kg、高劑量150 mg/kg），1次/d，共3 d；假手術組在手術中分離動脈，但不放置線栓、不結(jié)扎，術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d；模型組術后注射等體積生理鹽水，1次/d，共3 d。相較于假手術組，a P＜0.05；相較于模型組，b P＜0.05

組別假手術組模型組天麻素低劑量組天麻素中劑量組天麻素高劑量組F值P值Notch1 0.32±0.07 0.42±0.09 0.77±0.13ab 0.84±0.16ab 0.95±0.18ab 21.459 0.001 Jagged1 0.27±0.06 0.38±0.06 0.68±0.10ab 0.73±0.15ab 0.87±0.16ab 24.169＜0.001 Hes1 0.35±0.06 0.43±0.07 0.81±0.12ab 0.93±0.15ab 1.07±0.17ab 33.283＜0.001

討 論

在我國，腦卒中的發(fā)病率正逐年攀升，它具有高復發(fā)、高致殘、高致死的特點，關于該病的防治和預后判斷仍有許多問題需要探討。研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中的發(fā)病原因主要是由于腦組織血液局部供應障礙導致的腦組織缺氧性壞死，進而誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損［9］。在Papagianni等［10］的研究中，急性缺血性卒中患者會出現(xiàn)占位性腦水腫。Si等［11］建立大鼠腦動脈栓塞缺血性腦卒中模型用以探究6 h內(nèi)溶栓對缺血性腦卒中急性腦梗死的影響。本研究構(gòu)建的缺血性腦卒中模型與假手術組相比，大鼠神經(jīng)功能受損嚴重，腦含水量、腦梗死率顯著上升，表明模型構(gòu)建成功，并在此基礎上進行后續(xù)實驗。

天麻素是蘭科植物天麻提取物中的有效成分。Li等［12］研究發(fā)現(xiàn)，天麻素/PU膜可增強神經(jīng)突延伸，上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達。Jiao等［13］研究發(fā)現(xiàn)，天麻素抑制2，3，7，8-四氯二苯并對二噁英處理星形膠質(zhì)細胞誘導的PC12神經(jīng)元細胞凋亡。Li等［14］研究發(fā)現(xiàn)，天麻素預處理可顯著補償缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)行為缺陷，減少腦梗死面積，逆轉(zhuǎn)血腦屏障損傷，減輕炎性反應。Liu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，天麻素能顯著降低血腫溶血誘導的原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞活力和細胞凋亡，顯著改善腦出血后的腦水腫和神經(jīng)功能缺損，并且顯著提高腦出血72 h后Bcl-2表 達，降 低Bax、活 性Caspase-3、活 性Caspase-9水平，對神經(jīng)具有保護作用。Liu等［16］研究表明，天麻素通過下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2抑制細胞凋亡，并且靶向β相關蛋白的形成，抑制海馬神經(jīng)元自噬和凋亡。在此基礎上，本研究探討了天麻素對腦卒中大鼠的作用，發(fā)現(xiàn)天麻素可顯著降低腦卒中大鼠神經(jīng)功能受損程度、腦含水量、腦梗死率以及Caspase-3、Caspase-9活性，并且大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)目較模型組有所增加，細胞排列相對緊密，邊界較為清晰。這提示天麻素對腦卒中大鼠具有神經(jīng)保護作用，進一步豐富了天麻素的藥理作用。

Notch通路由Notch受體、配體和DNA結(jié)合蛋白-CSL構(gòu)成，在神經(jīng)前體細胞增殖、神經(jīng)元分化中起關鍵的調(diào)控作用［17-18］。Notch1主要表達于神經(jīng)干細胞或神經(jīng)前體細胞，Jagged1則主要表達于鄰近的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。Notch受體與配體結(jié)合則激活Notch通路。Wang等［19］研究表明，Notch信號缺失模型中存在miR-155表達上調(diào)。Wang等［20］的研究提示，活性Notch信號有助于卒中后神經(jīng)功能缺損恢復。Liu等［21］研究表明，Notch信號有助于腦卒中后血管生成，促進缺血區(qū)血供恢復。本研究結(jié)果顯示，天麻素可顯著下調(diào)腦卒中大鼠腦內(nèi)miR-155表達，顯著上調(diào)Notch1、Jagged1、Hes1的表達；提示天麻素對腦卒中大鼠的神經(jīng)保護作用可能是通過miR-155介導的Notch通路實現(xiàn)的。

綜上所述，天麻素可能通過下調(diào)miR-155的表達，激活Notch通路，從而對腦卒中大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究后續(xù)實驗將在此基礎上，進一步闡明天麻素對腦卒中的臨床價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突