張娟娟 閆曉培 李 寧

社區(qū)獲得性肺炎是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病。起始治療以經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療為主，部分患者治療失敗后出現(xiàn)病情延誤及進(jìn)展，對(duì)于初始治療失敗及重癥患者而言，明確病原體有利于精確指導(dǎo)治療，改善患者預(yù)后。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性率低，病原學(xué)培養(yǎng)周期長(zhǎng)，非典型病原體難以被培養(yǎng)。宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing， mNGS)是運(yùn)用高通量基因測(cè)序、不依賴傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)而明確樣本中所有微生物的分類和功能的技術(shù)，能夠快速、客觀地檢測(cè)臨床樣本中的病原微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲等，廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診治，較傳統(tǒng)的檢測(cè)手段更有優(yōu)勢(shì)，能明顯提高感染性疾病的診治效率和優(yōu)化抗生素的管理[1,2]。mNGS在成人社區(qū)獲得性肺炎的報(bào)道相對(duì)較少，本研究對(duì)蘇州市立醫(yī)院初治失敗的社區(qū)獲得性肺炎患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)進(jìn)行mNGS檢測(cè)，探討mNGS檢測(cè)技術(shù)在成人社區(qū)獲得性肺炎中的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：招募2018年11月～2021年7月蘇州市立醫(yī)院收治的57例初始治療效果不佳的社區(qū)獲得性肺炎患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②抗生素治療72h后出現(xiàn)咳嗽、咳痰或胸悶、氣急等癥狀未見(jiàn)好轉(zhuǎn)，仍有發(fā)熱，體溫大于38℃，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、降鈣素原或C反應(yīng)蛋白等炎性指標(biāo)持續(xù)升高，機(jī)械通氣；③抗感染2周后復(fù)查胸部CT，肺部病灶未吸收或較前進(jìn)展，所有患者抗生素治療失敗后均接受支氣管鏡檢查，采集BALF同時(shí)進(jìn)行了傳統(tǒng)方法和mNGS檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲；②臨床資料不完整。

2.資料收集：通過(guò)住院電子病歷系統(tǒng)，收集入選患者的性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、痰培養(yǎng)、抗生素使用情況、BALF病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果、影像學(xué)資料、治療前后的癥狀及體征、出院診斷等一般信息。

3.檢測(cè)方法：抗生素治療失敗后，57例患者均接受支氣管鏡檢查，所得BALF同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)方法和mNGS檢測(cè)。傳統(tǒng)方法包括細(xì)菌、真菌培養(yǎng)、利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(Xpert MTB/RIF)以及呼吸道病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測(cè)等。Xpert MTB/RIF kit 購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司。BALF的mNGS檢驗(yàn)由廣州微遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行，包括DNA和RNA兩部分測(cè)序。BALF的采集、保存及運(yùn)輸均符合標(biāo)準(zhǔn)[4]。將BALF進(jìn)行滅活處理，提取總核酸后，文庫(kù)制備包括隨機(jī)引物建庫(kù)、PCR擴(kuò)增等，對(duì)合格文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序,然后去除人源宿主序列,再與病原數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列進(jìn)行比對(duì)，來(lái)確定BALF中可能致病的微生物。參考疑似背景微生物庫(kù)及陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果，并結(jié)合所提供臨床信息，最終生成檢測(cè)報(bào)告。所有患者行支氣管鏡及mNGS檢測(cè)前均簽署知情同意書。本研究通過(guò)蘇州市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：K-2020-077-K01)。

4.臨床分析：57例患者的臨床病史、炎性指標(biāo)、胸部CT、病原學(xué)結(jié)果等資料均由兩位呼吸內(nèi)科主任醫(yī)師獨(dú)立分析并判斷病原菌。意見(jiàn)不統(tǒng)一的結(jié)果，共同討論后再?zèng)Q定。

結(jié) 果

1.一般臨床資料：57例社區(qū)獲得性肺炎患者中，男性29例(50.88%)，女性28例(49.12%)，患者平均年齡為59.23±15.76歲，重癥肺炎4例(7.02%)，入院平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)為(7.65±3.85)×109/L，中性粒細(xì)胞百分比為66.88%±13.67%，合并基礎(chǔ)疾病42例(73.68%)。

2.兩種檢測(cè)方法檢出結(jié)果比較：在57例社區(qū)獲得性肺炎的BALF中，傳統(tǒng)方法檢測(cè)19例標(biāo)本陽(yáng)性，檢出率為33.3%；BALF培養(yǎng)14例陽(yáng)性，Xpert MTB/RIF 7例陽(yáng)性，PCR檢測(cè)出1例H1N1。mNGS共檢出病原體46例，檢出率為80.7%。mNGS檢出率明顯高于傳統(tǒng)方法，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較，兩種方法均檢測(cè)出陽(yáng)性15例(26.32%)，陰性出7例(12.28%)，mNGS檢測(cè)陽(yáng)性而傳統(tǒng)方法檢測(cè)陰性者31例(54.39%)，mNGS檢測(cè)陰性而傳統(tǒng)方法檢測(cè)陽(yáng)性者4例(7.02%)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩種方法均檢測(cè)陽(yáng)性的15例中，結(jié)果完全一致有7例(12.28%)，部分一致有4例(7.02%)，不一致有4例(7.02%)，詳見(jiàn)圖1。在結(jié)核診斷方面，傳統(tǒng)方法檢測(cè)7例陽(yáng)性，mNGS 檢測(cè)4例陽(yáng)性；其中4例Xpert MTB/RIF和mNGS均檢測(cè)陽(yáng)性，3例Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性而mNGS檢測(cè)陰性。在細(xì)菌感染方面，mNGS檢出率43.9%，明顯高于傳統(tǒng)方法的檢出率15.8%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是在檢測(cè)真菌、結(jié)核及病毒感染方面，兩種方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 兩種方法檢出不同種類病原體的比較[n(%)]

圖1 mNGS與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果比較

3.診斷和治療的調(diào)整：將患者臨床表現(xiàn)、輔助檢查、mNGS結(jié)果及傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果綜合分析，由兩位年資高的呼吸科醫(yī)生獨(dú)立分析并判斷是否確診及其病原體。46例患者mNGS 檢測(cè)陽(yáng)性，其中39例(84.78%)予采信并確診，而7例因檢測(cè)結(jié)果與臨床表現(xiàn)、影像學(xué)結(jié)果不符合，未采信。在初治失敗的社區(qū)獲得性肺炎中，mNGS聯(lián)合傳統(tǒng)方法檢測(cè)后，共有43例患者確診。mNGS結(jié)果在確診和未確診患者中的情況詳見(jiàn)表2。由此計(jì)算出mNGS的敏感度為90.70%，特異性為50.00%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84.78%，陰性預(yù)測(cè)值為63.64%。43例確診患者中，細(xì)菌性肺炎17例，肺結(jié)核7例，非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous Mycobacteria，NTM)肺病6例，肺真菌感染5例，衣原體肺炎和支原體肺炎各1例，病毒性肺炎1例；其余5例為混合感染：細(xì)菌合并病毒感染3例，細(xì)菌合并真菌感染2例。57例患者中，25例患者根據(jù)mNGS結(jié)果調(diào)整了抗生素的治療方案。

表2 mNGS檢測(cè)在確診和未確診患者中的結(jié)果[n(%)]

討 論

社區(qū)獲得性肺炎是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)病及多發(fā)病，住院患者的病死率為2%～15%[5(7]。初治失敗的肺炎患者需要重復(fù)行病原學(xué)檢查明確致病病原體，并及時(shí)開(kāi)始精準(zhǔn)治療，以降低其病死率、避免抗生素濫用及遏制細(xì)菌耐藥。文獻(xiàn)報(bào)道傳統(tǒng)方法檢測(cè)的社區(qū)獲得性肺炎病原學(xué)陽(yáng)性率為38%[7]。mNGS是一項(xiàng)新型核酸檢測(cè)技術(shù)，能快速、客觀、全面地檢測(cè)臨床標(biāo)本中的細(xì)菌、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、病毒及寄生蟲等所有微生物，已廣泛應(yīng)用于感染性疾病中[8]。本研究中， mNGS檢測(cè)出46例陽(yáng)性，其中有39例確診，最后43.86%的患者根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果調(diào)整了抗生素方案。由此可見(jiàn)，對(duì)于社區(qū)獲得性肺炎患者，若初治失敗的患者，推薦留取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行mNGS檢測(cè)，可以早期識(shí)別病原體及時(shí)指導(dǎo)抗生素治療[4]。

Wang等[9]回顧性分析了55例血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的肺活檢和BALF送檢mNGS結(jié)果，其病原學(xué)檢出率明顯高于傳統(tǒng)方法，敏感度為97.2%，特異性為63.2%。Chen等[10]回顧了40例疑似肺炎患者的BALF mNGS，敏感度為81.3%，特異性為76.9%。本研究57例病例， BALF mNGS的病原學(xué)檢出率為80.70%，明顯高于傳統(tǒng)方法檢出率為33.33%。mNGS敏感度為90.70%，特異性為50.00%，敏感度與研究報(bào)道相似，特異性略低。

研究顯示，在感染性疾病中，mNGS較傳統(tǒng)方法對(duì)真菌、結(jié)核和病毒的檢出敏感度更高[11,12]。然而本研究中肺泡灌洗液mNGS的細(xì)菌檢出率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，但真菌、結(jié)核和病毒的檢出率無(wú)差異，這可能與本組病例特點(diǎn)有關(guān)。本研究除了4例重癥肺炎外，其余均是普通社區(qū)獲得性肺炎，總體病情較輕，并且大部分是免疫正常的社區(qū)獲得性肺炎，常見(jiàn)的病原體是以肺炎鏈球菌為主的細(xì)菌和支原體，真菌、結(jié)核和病毒感染較少見(jiàn)。

本研究中Xpert MTB/RIF檢出7例結(jié)核分枝桿菌，mNGS檢出3例，兩種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果無(wú)差異。由于結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)菌，釋放到體液中的含量少，核酸不容易被提取， 所以mNGS檢測(cè)的敏感度偏低[2]。當(dāng) BALF mNGS的結(jié)核分枝桿菌序列數(shù)和豐度很低時(shí)，也要考慮肺結(jié)核的可能。研究顯示，將疑似結(jié)核患者的標(biāo)本同時(shí)送檢mNGS和Xpert MTB/RIF，mNGS檢出結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異性與Xpert MTB/RIF類似[13～15]。若將兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，敏感度和特異性會(huì)明顯升高，mNGS還可以同步檢出結(jié)核患者伴隨感染的其他病原體，但檢測(cè)前的試驗(yàn)性抗結(jié)核治療會(huì)降低mNGS的陽(yáng)性率[13]。

本研究mNGS共檢出9例NTM，6例診斷為NTM肺病，其余3例因序列數(shù)較少且與臨床表現(xiàn)不符合而未采信。文獻(xiàn)報(bào)道，NTM的發(fā)生率和患病率呈逐年增加的趨勢(shì)[16,17]。在社區(qū)獲得性肺炎患者初治失敗后，需要警惕NTM感染可能，尤其是有結(jié)構(gòu)性基礎(chǔ)肺病的老年患者[18]。因?yàn)镹TM廣泛存在于環(huán)境中，可能造成標(biāo)本的污染，mNGS送檢標(biāo)本排除環(huán)境污染后，若NTM序列數(shù)位于前10位時(shí)，需要考慮為NTM感染[12]。相比傳統(tǒng)培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，mNGS檢測(cè)NTM的優(yōu)勢(shì)更明顯，從采樣到完成數(shù)據(jù)分析的周轉(zhuǎn)時(shí)間平均48h，還可以確定NTM的具體種類[4，14]。

mNGS也有自身的局限性，無(wú)法區(qū)分感染和定植，耐藥檢測(cè)困難，其敏感度高可能存在假陽(yáng)性，缺乏統(tǒng)一的解讀標(biāo)準(zhǔn)，臨床實(shí)踐中可能存在錯(cuò)誤解讀，臨床工作者必須綜合考慮患者的臨床癥狀、影像學(xué)特點(diǎn)、自身免疫情況等，才能得出最終的結(jié)論。

綜上所述，在初始治療失敗的社區(qū)獲得性肺炎患者中，BALF mNGS的檢出率高于傳統(tǒng)方法，尤其是對(duì)于細(xì)菌感染的診斷價(jià)值更高，可早期識(shí)別病原體，有效指導(dǎo)診治。由于本研究是回顧性研究，納入樣本量少，無(wú)法避免選擇性偏倚；因住院資料局限性，無(wú)法比較調(diào)整抗生素方案后的治療效果；因選擇的樣本是社區(qū)獲得性肺炎患者且大部分是輕癥，無(wú)法全面反映mNGS的檢測(cè)效能，還需要開(kāi)展大量前瞻性研究予以進(jìn)一步證實(shí)。