楊善軍 王 玥 邢露茗 張曉瑩 封 笑 肖 洋 付 晉 王 浩 李希堯

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院肺病科，哈爾濱，150001； 2 北京中醫(yī)藥大學，北京，100029)

肺纖維化(Pulmonary Fibrosis，PF)是由多種因素引起的慢性肺部疾病，以炎癥、成纖維細胞聚集和細胞外基質沉積為特征，最終導致肺結構破壞，阻礙血氣交換[1]。目前常用免疫抑制劑(例如潑尼松龍)進行治療，但由于療效低和不良反應嚴重而受到限制，迫切需要具有改善的治療功效和更少的不良反應的新治療方法[2]。中醫(yī)學認為，PF病變的實質是“肺絡瘀滯”，屬于“肺痹”“肺痿”等范疇。中醫(yī)有大量使用中藥方劑和麥粒灸治療肺痿的文獻記載。化瘀理肺方可以明顯減輕大鼠肺泡炎和肺纖維化程度[3]。同時，麥粒灸肺俞治療PF的療效得到肯定[4]。但是中藥和針灸治療PF的作用機制尚不完全清楚。隨著免疫機制研究的不斷深入，炎癥細胞和各種細胞因子在肺纖維化發(fā)病中的作用也受到人們越來越多的關注[5]。在參與纖維化進程的多種信號通路中，核因子κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)信號通路起關鍵作用[6]。核因子κB是上皮-間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的重要介質，可促進多種炎癥介質的轉錄，如腫瘤壞死因子-α(Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α)、白細胞介素(Interleukin，IL)和轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)等，這些因子與PF的進展密切相關，尤其是TGF-β，在評價PF的藥物療效時，必須對這些因素進行檢測[7]。因此，本研究用博來霉素制備大鼠PF模型，檢測麥粒灸聯(lián)合補肺祛瘀方對PF大鼠肺功能的改善作用，并探討核因子κB信號通路的調(diào)控作用，為麥粒灸合補肺祛瘀方治療PF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 體質量(200±20)g的SD大鼠購黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)2018-003，在溫度(23±2)℃，濕度60%～70%，的環(huán)境中實用性喂養(yǎng)1周后進行實驗。實驗方案經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審批號：[2020]黑中醫(yī)倫理審字第012號)。

1.1.2 藥物 補肺祛瘀方：由丹參20 g、黃芪20 g、虎杖20 g、川芎20 g、麥冬20 g共5味中藥組成，加6倍量水煎煮提取2次，1 h/次，合并水煎液濃縮至77 mL，藥物濃度為1.3 g/mL，冰箱貯存?zhèn)溆?；艾絨(薊春千年艾科技有限公司生產(chǎn)，批號：54823)醋酸潑尼松片(江蘇鵬鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:1404273)；博來霉素(Invitrogen公司，美國，批號：R250-01)。

1.1.3 試劑與儀器 Masson染液和蘇木精染色液(上海歌凡生物科技有限公司，批號：G200315)；IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunoadsorption Assay，ELISA)試劑盒(上海歌凡生物科技有限公司，貨號：G20021-3、G20014-2、G20062-4)；Trizol試劑[生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號：SG569]；ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉錄試劑盒和THUNDERBIRD qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒(ToYoBo有限公司，日本，貨號：FSQ-101、QPS-201)；核因子κB上游引物為5′-GCTACACAGAGGCCATTGAA-3′,下游引物為5′-TCCCGGAGTTCATCTATGTG-3′；TGF-β上游引物為5′-TGTACGGCAGTGGCTGAACCAA-3′,下游引物為5′-CGCTGAATCGAAAGCCCTGTATT-3′；Smad2(Small Mother Against Decapentaplegic 2)信號轉導分子2上游引物為5′-CCCTTCAATGGTTGGTACATGG-3′,下游引物5′-ACATTGATCTCCGTGACAGCC-3′；GAPDH引物序列：上游引物為5′-TGCGACTTCAACAGCAACTC-3′，下游引物為：5′-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3′；組織脫水機和全自動輪轉切片機(德國徠卡生物科技有限公司，德國，型號：ASP300S、Leica RM2255)；顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司，型號：BX41)；無創(chuàng)動物肺功能儀(北京吉安得爾科技有限公司，型號：BUXCO)；蛋白核酸檢測儀(NanoDrop公司，美國，型號：NanoDrop2000c)；全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(北京樂普醫(yī)療科技有限責任公司，型號：Lepgen-96)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取60只成年SD大鼠(雌雄各半)按隨機數(shù)字表法均分為空白對照組、模型組、潑尼松龍組、麥粒灸組、方藥組、灸藥組，每組10只。麻醉大鼠，輕拉鼠舌壓迫舌腹，窺見聲口，趁大鼠呼吸瞬間，迅速將與裝有博來霉素溶液注射器相連的頂端磨鈍的9號腰穿針插入達氣管分叉處，隨后慢慢推入博來霉素(5 mg/kg)溶液。給藥結束時，輔助大鼠作直立、旋轉等動作，以便藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，然后讓大鼠自由飲水、進食。

1.2.2 給藥方法 造模第7天后開始治療，潑尼松龍組灌胃給予潑尼松龍(5 mg/kg)，麥粒灸組選取肺的背腧穴“肺俞”、治肺虛效穴“膏肓”，灸的方式選取麥粒灸，定位方式參考《實驗針灸學》和《中國獸醫(yī)針灸學》[9]；方藥組釆用灌胃給予補肺祛瘀方(生藥量5 g/kg)[10]；灸藥組同時進行麥粒灸和灌胃補肺祛瘀方；空白組和模型組按等容量生理鹽水灌胃，1次/d，共治療30 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 大鼠肺功能檢測 末次治療2 h后，對大鼠進行麻醉，將大鼠置于體描箱中，行氣管插管，鏈接RES3020動物呼吸機，待數(shù)據(jù)曲線穩(wěn)定后用BUXCO無創(chuàng)動物肺功能儀系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，包括用力肺活量(Forced Vital Capacity，F(xiàn)VC)、最大通氣量(Maximal Voluntary Ventilation，MVV)和肺動態(tài)順應性(Dyanamic Compliance，Cdyn)。

1.2.3.2 大鼠肺組織病理學檢測 大鼠做完肺功能檢測后，處死大鼠，分離肺組織，每組用5只大鼠右肺上葉進行甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、包埋、切片后，進行Masson和蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，觀察肺組織病理學變化。

1.2.3.3 支氣管肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平檢測 每組用5只大鼠進行右側主支氣管近端和氣管遠端結扎，在氣管結扎下端用0.3 mL預冷生理鹽水進行右肺灌洗，重復3次，回收支氣管肺泡灌洗液，6 000 r/min，離心半徑11.2 cm，離心時間30 min，取上清液；用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，操作步驟說明書進行。

1.2.3.4 肺組織中核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA水平檢測 將左肺組織進行研碎，用TRIzol提取總RNA，用NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀對RNA的濃度和純度進行測定，根據(jù)ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉錄試劑盒說明合成cDNA，再根據(jù)THUNDERBIRD qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒說明，制備20 μL反應體系進行PCR擴增，擴增條件為95 ℃ 30 s預變性、95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 44 s、40個循環(huán)，61 ℃時采集熒光，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA的表達量。

2 結果

2.1 麥粒灸合補肺祛瘀方對PF大鼠肺組織病理學形態(tài)的影響 Masson染色顯示，對照組大鼠肺組織未見明顯纖維化；模型組肺組織中膠原沉積明顯，特別是支氣管周圍；經(jīng)潑尼松龍、麥粒灸和方藥治療后，肺組織膠原沉積明顯減少，其中潑尼松龍組改善最顯著；HE染色顯示，對照組大鼠肺組織未見明顯異常；模型組大鼠肺部表現(xiàn)出纖維增生，炎癥細胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡破壞和紊亂以及肺泡間隙部分塌陷；經(jīng)潑尼松龍、麥粒灸和方藥治療后，肺組織在炎癥和纖維化明顯改善，其中潑尼松龍組改善最顯著。見圖1～2。

圖1 麥粒灸合補肺祛瘀方對PF大鼠肺組織病理學形態(tài)的影響(Masson染色，×200)

圖2 麥粒灸合補肺祛瘀方對PF大鼠肺組織病理學形態(tài)的影響(HE染色，×200)

2.2 麥粒灸合補肺祛瘀方對PF大鼠肺功能的影響 與空白對照組比較，其余各組大鼠FVC、MVV和Cdyn降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療大鼠FVC、MVV和Cdyn升高，其中灸藥組療效好于麥粒灸組和方藥組，而潑尼松龍組療效最好(P<0.05)。見表1。

表1 麥粒灸合補肺祛瘀方對PF大鼠肺功能的影響

2.3 麥粒灸合補肺祛瘀方對PF大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 與空白對照組比較，其余各組大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6降低，其中灸藥組療效好于麥粒灸組和方藥組，而潑尼松龍組療效最好(P<0.05)。見表2。

表2 各組PF大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較

2.4 麥粒灸合補肺祛瘀方對PF大鼠肺組織中核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA水平的影響 與空白對照組比較，其余各組大鼠肺組織中核因子κB、TGF-β和Smad2升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療大鼠肺組織中核因子κB、TGF-β和Smad2降低，其中灸藥組療效好于麥粒灸組和方藥組，而潑尼松龍組療效最好(P<0.05)。見表3。

表3 各組PF大鼠肺組織中核因子κB、TGF-β和Smad2 mRNA水平比較

3 討論

PF是一種慢性、致命的間質性肺疾病，以肺泡炎癥和肺纖維化為主要特征，盡管有很多藥物(如潑尼松龍)被用于治療PF，但其療效有限，中位生存時間在2～4年。因此，尋找新的PF治療方法具有重要意義。多年來，我們在臨床上以麥粒灸和方劑配合方法治療肺纖維化，療效肯定。研究表明，麥粒灸肺俞、膏肓俞可以改善肺功能，增加肺通氣量[11]。同時，補肺祛瘀方中黃芪味甘微溫，入肺脾經(jīng)，具有補中益氣的功效；麥冬養(yǎng)陰潤肺，治肺燥咳嗽，助君藥潤肺之功；虎杖具有清熱解毒、止咳化痰的功效；丹參和川芎具有祛瘀生新之力。全方具有補氣養(yǎng)陰、化瘀祛痰之功[12]。本研究結果顯示，麥粒灸聯(lián)合補肺祛瘀方改善肺功能的效果強于單獨麥粒灸或補肺祛瘀方治療，同時減輕了博來霉素誘導的肺部炎癥和纖維化。此外，在博來霉素誘導的炎癥反應中，麥粒灸聯(lián)合補肺祛瘀方治療抑制了核因子κB信號通路的激活。

在肺部博來霉素暴露的早期階段，肺泡上皮細胞受到DNA損傷并釋放出活性氧，這將引起強烈的炎癥反應，其中炎癥細胞會滲透到肺組織并開始纖維化。博來霉素誘導纖維化的炎癥細胞主要包括中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。其中，巨噬細胞會分泌趨化因子，招募炎癥細胞和促纖維化細胞因子，如TNF-ɑ和IL-6，以創(chuàng)造纖維化微環(huán)境[13]。同時，同時還釋放TGF-β誘導細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)的積累，誘導成纖維細胞產(chǎn)生高水平ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑ-Smooth Muscle Actin，ɑ-SMA)和膠原蛋白[14]。這些細胞因子的啟動子區(qū)域包含與核因子κB的結合位點，因此，轉錄因子可以調(diào)節(jié)核因子κB基因表達[15]。本研究結果顯示，麥粒灸聯(lián)合補肺祛瘀方降低了大鼠肺泡灌洗中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

核因子κB信號通路依賴的炎癥反應在許多炎癥性和纖維化疾病中起關鍵作用，并在博萊霉素介導的氣道重塑中發(fā)揮重要作用。在巨噬細胞中，核因子κB信號參與病原相關的分子模式[16]。核因子κB信號通路的激活核因子κB抑制因子(Inhibitor of NF-κB,I-κB)激酶，I-κB降解導致核因子κB p50/核因子κB p65二聚體的磷酸化和易位，最終導致各種基因的轉錄。博萊霉素刺激導致IkB磷酸化，導致核因子κB轉位到細胞核[17]。研究表明，炎癥介質和促纖維細胞因子在PF進程中發(fā)揮關鍵作用。這些細胞因子的調(diào)節(jié)部分是由核因子κB介導的[18]。因此，核因子κB仍然是抗纖維化藥物的一個有吸引力的靶點。盡管炎癥細胞會產(chǎn)生趨化因子和細胞因子促使肺組織損傷和重塑，但TGF-β是一種被巨噬細胞激活的關鍵纖維化細胞因子，在成纖維細胞重塑中起著關鍵作用。動物模型和PF患者的肺組織中TGF-β均升高[19]。TGF-β可調(diào)控成纖維細胞向肺成纖維細胞遷移，增殖和分化為成纖維細胞，其特征在于α-SMA的表達和ECM的沉積。在炎癥條件下，內(nèi)皮細胞上的Smad2表達主要是由活性氧誘導的。同時，通過阻斷白細胞與Smad2的結合或抑制Smad2信號轉導來抑制炎癥[20]。高濃度的活性氧激活了核因子κB并促使成纖維細胞中表達Smad2[21-22]。本研究結果顯示，麥粒灸聯(lián)合補肺祛瘀方抑制核因子κB、TGF-β和Smad2的活性。

綜上所述，麥粒灸合補肺祛瘀方可能通過抑制核因子κB信號通路，降低PF大鼠肺組織炎癥水平，并改善肺部微結構，從而改善PF大鼠肺功能，為麥粒灸合補肺祛瘀方治療PF提供理論依據(jù)。