回 晶，白琦琦，楊 瑩，張業(yè)崎

(遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

益生菌是一類定殖于動物口腔、腸道或生殖道內(nèi)，對宿主有益的活性微生物.益生菌既有細(xì)菌類又有真菌類，主要分為乳桿菌類、雙歧桿菌類、鏈球菌類以及酵母菌類4種類型.益生菌應(yīng)用十分廣泛，在人類生活的方方面面都起著重要的作用，它既可以作為治療腹瀉的藥物和促進(jìn)腸道健康的保健食品，又可以作為畜禽飼料來提高動物生產(chǎn)性能.近年來，人們發(fā)現(xiàn)益生菌可替代抗生素且不產(chǎn)生副作用，其中雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌目前已被廣泛使用，但它們的耐熱性和抗逆性較差，在產(chǎn)品中更難以長時間存活，因此繼續(xù)尋找新的益生菌菌株以滿足實際的使用需要顯得尤為重要.

不同于市面上大多數(shù)的益生菌，布拉氏酵母菌(S.Boulardii)是一種真菌類益生菌，該菌屬于釀酒酵母益生菌的亞種，具有釀酒酵母益生菌特性的同時卻比釀酒酵母益生菌具有更高的耐酸耐熱性.布拉氏酵母菌作為微生態(tài)制劑的一種，具有天然、無毒副作用、安全可靠、無殘留等多重優(yōu)點(diǎn)，可與抗生素同時使用，并能有效預(yù)防抗生素濫用導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)[1].雖然布拉氏酵母菌具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但人體環(huán)境十分苛刻，布拉氏酵母菌只有在胃膽環(huán)境中具備穩(wěn)定的耐受能力，才能夠在進(jìn)入人體后順利抵達(dá)腸道并發(fā)揮其功能，可見深入開展布拉氏酵母菌益生性和功能性的研究，對于其功能和安全的后續(xù)探究是不可缺少的前提.

1 材料與試劑

1.1 主要試劑

本文的主要試劑：胃蛋白酶、牛膽鹽、無菌生理鹽水、稀鹽酸、膽固醇、冰乙酸、巰基乙酸鈉、鄰苯二甲醛、氫氧化鉀、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、正己烷、鐵氰化鉀、濃硫酸、三氯化鐵(FeCl3)、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚.

1.2 培養(yǎng)基

本文所用培養(yǎng)基如下：酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)，MRS培養(yǎng)基，膽鹽培養(yǎng)基和高膽固醇培養(yǎng)基.膽鹽培養(yǎng)基的制備方法：取牛膽鹽于液體培養(yǎng)基中，使膽鹽濃度(g/mL)為0.3%、0.5%，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用；高膽固醇培養(yǎng)基的制備方法：向培養(yǎng)基中加入0.2%巰基乙酸鈉、0.3%牛膽鹽及100 μg/mL膽固醇.

1.3 儀器與設(shè)備

本文所使用的儀器為V7000D型紫外分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)和LC-RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海力辰邦西儀器科技有限公司).

2 實驗方法

2.1 耐模擬胃液實驗

本實驗取4.5 mL現(xiàn)配現(xiàn)用的模擬胃液與0.5 mL的布拉氏酵母菌懸液混合，37 ℃培養(yǎng)6 h，在培養(yǎng)過程中，分別于0、1、3和6 h無菌取出0.1 mL混合液并作適當(dāng)稀釋，30 ℃培養(yǎng)48 h，采用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)[2]，計算存活率[3-4].

(1)

2.2 耐膽鹽實驗

本實驗將布拉氏酵母菌懸液按3%的接種量接種于5 mL不同濃度的膽鹽培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)6 h，在培養(yǎng)過程中，分別于0、3和6 h無菌取出培養(yǎng)液并作適當(dāng)稀釋，30 ℃培養(yǎng)48 h，測定活菌數(shù)[2]，計算存活率[5].

(2)

2.3 體外降膽固醇能力

本實驗以膽固醇濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，OD550為縱坐標(biāo)，繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線[6-7].通過鄰苯二甲醛(OPA)法進(jìn)行測定[8]膽固醇去除率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中膽固醇含量.

(3)

式中：C0為未接種培養(yǎng)液離心上清液中膽固醇實測質(zhì)量濃度，μg/mL；C為接種后發(fā)酵液離心上清液中膽固醇實測質(zhì)量濃度，μg/mL.

比特幣是最具有代表性的密碼貨幣之一，后續(xù)的密碼貨幣在一定的程度上是延續(xù)比特幣的技術(shù)原理。當(dāng)然后續(xù)的密碼貨幣在共識機(jī)制、交易匿名性以及數(shù)據(jù)隱私保護(hù)方面都取得了較大突破。例如：以太坊[1]利用權(quán)益證明（PoS）機(jī)制，大幅度縮減挖礦開銷的計算資源；門羅幣利用可鏈接環(huán)簽名技術(shù)[2]，為發(fā)送者提供匿名保護(hù)，同時可以檢測雙重支付；零幣[3]采用非交互零知識證明機(jī)制[4]進(jìn)一步提高了匿名性，實現(xiàn)了發(fā)送者和接收者匿名以及數(shù)據(jù)隱私，但是計算和存儲開銷增大。本節(jié)主要介紹比特幣的生成背景和研究意義。

2.4 布拉氏酵母菌的抗氧化能力

2.4.1 DPPH·清除率

本文參考Kandi[9]的方法，采用分光光度法[10-11]，將0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液與待測菌懸液按1∶1體積比混合，振蕩，室溫下暗反應(yīng)30 min后，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，于517 nm波長處測定上清液的吸光值，并以乙醇溶液調(diào)零，清除率按下式計算：

(4)

式中：Ai為1 mL待測菌懸液加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值；Aj為1 mL待測菌懸液加1 mL無水乙醇的吸光值；Ac為1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)加1 mL DPPH乙醇溶液的吸光值.

2.4.2 ·OH清除率

本文參考畢秋蕓[12]的方法并略作改動[13]，測定羥自由基清除率.清除率按下式計算：

(5)

式中：Am為含有樣品和H2O2的吸光值；An為不含樣品但含H2O2的吸光值；A0為不含樣品和H2O2的吸光值.

2.4.3 總還原力

本文參考林祥娜等[13]、黃麗等[14]的鐵氰化鉀法，向15 mL離心管中加入0.5 mL待測菌懸液，0.5 mL 1%鐵氰化鉀，0.5 mL 0.2 mol/L pH 6.8 PBS，充分混勻后，50 ℃保溫20 min；迅速冷卻后，加入0.5 mL 10% 三氯乙酸(TCA)，沉淀蛋白后，3 500 r/min離心10 min并收集上清液.取1 mL上清液，加入1 mL 0.1%的FeCl3溶液，于700 nm處測定吸光值，以抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定總還原力.

本文參考何美書[15]的方法并略作改動[16]，測定超氧陰離子自由基清除率.清除率按下式計算：

(6)

式中：A11為含樣品和鄰苯三酚的吸光值；A10為含樣品但不含鄰苯三酚的吸光值；A01為不含樣品但含鄰苯三酚的吸光值；A00為不含樣品和鄰苯三酚的吸光值.

3 結(jié)果與討論

3.1 耐模擬胃液實驗

益生菌在抵達(dá)腸道環(huán)境之前，需要以活菌的形式通過胃部酸性環(huán)境，因此，益生菌在酸性胃液里仍需要有較高的存活率是發(fā)揮其功能的前提之一[17-18].在正常pH值下(見表1)，布拉氏酵母菌的存活率不低于100%，模擬胃液pH=4時(見表2)，布拉氏酵母菌幾乎不受影響，能夠很好存活.模擬胃液pH=3時(見表3)，隨著時間的增加存活率略有降低，6 h后的存活率仍高達(dá)96.27%，優(yōu)于對照組鼠李糖乳桿菌(LGG).因此可知，在模擬胃液實驗中，布拉氏酵母菌的存活情況良好，能夠耐受胃液環(huán)境.

表1 布拉氏酵母菌對空白模擬胃液的耐受能力

表2 布拉氏酵母菌對pH=4模擬胃液的耐受能力

表3 布拉氏酵母菌對pH=3模擬胃液的耐受能力

3.2 耐膽鹽實驗

正常情況下，人體腸道中膽鹽濃度變化范圍是0.03%～0.3%，益生菌只有能夠抵抗膽鹽的拮抗作用才有可能在腸道中定殖發(fā)揮益生作用[19-20].所設(shè)置的不加膽鹽空白對照組環(huán)境下(見表4)，布拉氏酵母菌在6 h后存活率維持在100%左右.布拉氏酵母菌在0.3%濃度膽鹽環(huán)境下(見表5)，布拉氏酵母菌生存受到影響，3 h存活率為89.98%，6 h存活率為78.15%，對照菌鼠李糖乳桿菌在作用了6 h后存活率為83.69%，與布拉氏酵母菌存活率相近.在0.5%濃度膽鹽環(huán)境下(見表6)，布拉氏酵母菌在經(jīng)過3 h的膽鹽反應(yīng)后，其活菌數(shù)量下降，存活率為78.55%，低于同等時長0.3%濃度膽鹽實驗，在0.5%濃度膽鹽作用6 h時，已檢測不到活菌.由此可知，布拉氏酵母菌對于0.3%濃度膽鹽環(huán)境具有良好耐受能力，但對于0.5%的膽鹽環(huán)境不具有耐受能力.

表4 布拉氏酵母菌對空白膽鹽的耐受能力

表5 布拉氏酵母菌對0.3%濃度膽鹽的耐受能力

表6 布拉氏酵母菌對0.5%濃度膽鹽的耐受能力

3.3 布拉氏酵母菌對膽固醇的降解能力

在硫酸存在的條件下，由于膽固醇及其酯與鄰苯二甲醛作用會產(chǎn)生紫紅色的物質(zhì)，該物質(zhì)在550 nm有最大吸收值，因此可以用比色法測定膽固醇含量[21].由圖1可知，布拉氏酵母菌的膽固醇清除率為25.05%，清除量為16.37 μg/mL，與對照的鼠李糖乳桿菌相比，布拉氏酵母菌的體外膽固醇清除率略低于鼠李糖乳桿菌，具有較好的膽固醇降解能力.

圖1 布拉氏酵母菌對膽固醇的降解能力

3.4 布拉氏酵母菌的抗氧化能力

3.4.1 DPPH·清除能力

DPPH·是一種相對比較穩(wěn)定的自由基，當(dāng)DPPH溶液中加入抗氧化劑時DPPH·吸收能力將會減弱，DPPH·的清除能力經(jīng)常用于評價物質(zhì)抗氧化的能力[22-23].由圖2(a)可以看出，布拉氏酵母菌在106～108CFU/mL均具有清除DPPH·的能力，且隨著菌體濃度的增大，清除能力隨之增強(qiáng).與對照組相比，布拉氏酵母菌對DPPH·的清除能力比鼠李糖乳桿菌略低，但差異不大，仍有較好的清除DPPH·的能力.

3.4.2 ·OH清除能力

鄰二氮菲-Fe2+是一種氧化還原指示劑，它的顏色改變可反映溶液中氧化還原狀態(tài)的變化.通過Feton反應(yīng)體系，產(chǎn)生的·OH可使鄰二氮菲水溶液氧化成鄰二氮菲-Fe3+，通過測定536 nm處的吸光值變化反映系統(tǒng)中·OH的變化[24].由圖2(b)可以看出，布拉氏酵母菌菌體濃度為106CFU/mL時，·OH的清除能力較弱，但當(dāng)菌體濃度達(dá)到108CFU/mL時可達(dá)到41.26%，略低于鼠李糖乳桿菌，但差異不顯著，具有較好的·OH清除能力.

3.4.3 總還原力

鐵氰化鉀在弱酸性的環(huán)境下能夠還原生成黃血鹽[K4Fe(CN)6]，之后再與FeCl3提供的Fe3+作用生成普魯士藍(lán).還原能力的強(qiáng)弱常以普魯士藍(lán)的生成量為指標(biāo)，通過測定其在700 nm處的吸光值(A700)的大小來判定物質(zhì)的還原能力強(qiáng)弱[25].A700越大，其還原能力越大，還原能力是通過轉(zhuǎn)化為抗壞血酸的量來表示的.結(jié)果如圖2(c)所示，不同菌體濃度的總還原能力差異顯著.隨著菌體濃度增加，布拉氏酵母菌的還原能力比鼠李糖乳桿菌略強(qiáng)，當(dāng)菌體濃度達(dá)到108CFU/mL時，布拉氏酵母菌轉(zhuǎn)化為抗壞血酸的濃度高達(dá)25.79 μmol/L.由此可知，布拉氏酵母菌具有較強(qiáng)的還原能力.

圖2 布拉氏酵母菌的抗氧化能力(不同小寫字母代表布拉氏酵母菌菌體濃度對清除能力差異顯著性；不同大寫字母代表鼠李糖乳桿菌菌體濃度對清除能力差異顯著性)