王振寶，楊妍妍，劉冰江，霍雨猛，李艷偉，孫亞玲，吳雄

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山東 濟(jì)南 250100)

洋蔥(Allium cepaL.)又名圓蔥、蔥頭、球蔥等，為百合科蔥屬二年生草本植物。洋蔥于二十世紀(jì)初期引入我國，具有適種性廣、易栽培的特點(diǎn)，我國南北方均有栽培，目前我國洋蔥的生產(chǎn)面積和產(chǎn)量均居全球第一，約占世界洋蔥生產(chǎn)總面積的30%左右，是重要的出口創(chuàng)匯蔬菜[1]。洋蔥以肉質(zhì)鱗莖為主要食用器官，是黃酮醇類化合物的重要食物來源。黃酮醇類化合物一般具有較強(qiáng)的抗氧化性[2]，起到抑菌抗炎、抗過敏、保護(hù)心血管、防癌等作用[3]。

黃酮類化合物作為重要的次生代謝物廣泛存在于植物中，可以保護(hù)植物免受生物和非生物脅迫的危害[4，5]。因其分子中含有酮基而呈現(xiàn)黃色，從而賦予植物花、果實(shí)、種子等組織器官不同的顏色。黃酮醇類化合物是最為常見的黃酮類化合物，占黃酮類化合物總數(shù)的1/3左右，是洋蔥鱗莖產(chǎn)生黃色的主要因素。黃酮醇合成酶(flavonol synthase，F(xiàn)LS)是黃酮醇生物合成的直接調(diào)控酶，也是連接類黃酮類合成途徑和兒茶素合成途徑的橋梁，它以二氫黃酮醇為底物，催化黃酮結(jié)構(gòu)中的C3位發(fā)生羥基化形成各種黃酮醇類物質(zhì)[6，7]。黃酮醇合成酶在植物中非常保守[8]，汪慶昊等[9]根據(jù)FLS基因保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，成功克隆了杜鵑FLS基因的全長序列。目前已經(jīng)從葡萄風(fēng)信子[10]、青天葵[11]、日本蛇根草[12]等植物中分離、克隆了FLS基因。

關(guān)于洋蔥花青素合成途徑相關(guān)基因的研究已經(jīng)較為成熟，目前已經(jīng)克隆了CHI、DFR、ANS、UFGT等基因并做了詳細(xì)研究[13－17]，但是關(guān)于洋蔥FLS基因的研究相對較少。Park等[18]克隆了洋蔥的FLS基因，并對3個(gè)月苗期紅皮和黃皮洋蔥中FLS基因?qū)Φ孜锏拇呋?、FLS基因及花青素生物合成途徑基因的表達(dá)水平做了研究。本研究克隆了洋蔥FLS基因的編碼序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)對其在不同皮色洋蔥的不同組織及鱗莖膨大期的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，以期為揭示洋蔥鱗莖顏色的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黃皮洋蔥DH17－1未開放花蕾為試材，克隆FLS基因。取樣后立即用液氮速凍，于－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

以紫皮洋蔥175F和黃皮洋蔥DH17－1為試材，選取鱗莖膨大前的根、葉鞘和葉片以及鱗莖膨大初期、盛期、末期和收獲期的外層肉質(zhì)鱗片用于FLS基因的表達(dá)分析。蒸餾水沖洗干凈后，分別用錫箔紙包好，立即用液氮速凍，于－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 洋蔥總RNA的提取及cDNA的制備

洋蔥總RNA采用Trizol(Invirtrogen公司)法提取，具體方法參照說明書。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser[寶生物工程(大連)有限公司]說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.3 PCR擴(kuò)增

克隆洋蔥FLS基因的正向引物為FLS－F:5′－CATCAGAGTTCATCAGATCGGACCA－3′，反向引物為FLS－R:5′－GCATAATCTTTGTATTTTTTGGTCT－3′，由青島蔚來生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(25 μL):模板(cDNA)1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，10×LATaqbuffer 2.5 μL，引物各1 μL，TaKaRa LATaq0.25 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)齊至25 μL；擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照記錄。

將目的片段切膠回收，送青島蔚來生物科技有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用NCBI在線進(jìn)行開放閱讀框的查找和結(jié)構(gòu)域分析；分別利用ProtParam、NetPhos－3.1、ProtScale、SOPMA、SWISS－MODEL和ProtComp 9.0進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析、親疏水性分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和亞細(xì)胞定位；分別利用Blastp、DNAMAN進(jìn)行氨基酸同源序列檢索和氨基酸序列比對。

1.5 基因表達(dá)模式分析

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)AcFLS基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，正向引物AcFLS－F:5′－CCTGGGTTGATTACTTGTTTC－3′，反向引物AcFLSR:5′－CTTGTTTACCGTTGTTCTGTG－3′，分析儀器為Bio－Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀。PCR擴(kuò)增體系:2×SYBR Green qPCR Master Mix 10.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序采用三步法:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線制備溫度為65.0～95.0℃。

每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以β－Actin基因?yàn)閮?nèi)參，正向引物Actin－F:5′－ACACGGCCTGGATAGCAACAT－3′，反向引物Actin－R:5′－AGAGCAGTATTCCCAAGCATT－3′。目的基因相對轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平參照Livak等[19]的方法，采用2－ΔΔCt公式進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥FLS基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以洋蔥未開放花蕾cDNA為模板，通過RTPCR方法克隆得到了洋蔥FLS基因的cDNA序列，片段大小約950 bp(圖1)，命名為AcFLS。NCBI在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測AcFLS共有11條開放閱讀框，其中最大的一條為927 bp，編碼309個(gè)氨基酸。利用ProtParam對AcFLS基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，AcFLS編碼蛋白質(zhì)的分子式為C1605H2467N419O462S7，總原子數(shù)為4 960，分子量為35 249.19 Da，理論等電點(diǎn)(pI)為6.20，負(fù)電荷殘基(Asp＋Glu)總數(shù)為40，正電荷殘基(Arg＋Lys)總數(shù)為35，脂肪系數(shù)84.47，不穩(wěn)定指數(shù)42.35，為不穩(wěn)定蛋白，平均親水性(GRAVY)為－0.515，預(yù)測為親水性蛋白。

圖1 洋蔥FLS基因RT－PCR電泳圖

2.2 AcFLS蛋白磷酸化位點(diǎn)及親疏水性分析

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白活力和功能的重要調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)的傳遞過程中起到極其重要的作用。利用NetPhos－3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos－3.1)進(jìn)行Ac-FLS蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示，AcFLS蛋白共有12個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)(圖2)。

圖2 AcFLS蛋白氨基酸序列及磷酸化位點(diǎn)

ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)親疏水性分析結(jié)果表明(圖3)，AcFLS蛋白存在6個(gè)低分值峰(Score＜－2)，分別分布于0～50、100～150、250～300和300～309氨基酸之間，這些區(qū)域?qū)儆谟H水性區(qū)域；2個(gè)高分值峰(Score＞1.5)，分布于200～250氨基酸之間，屬于高疏水性區(qū)域。從整條肽鏈的氨基酸預(yù)測值來看，AcFLS蛋白處于親水性區(qū)域明顯多于疏水性區(qū)域，所以該蛋白為親水性蛋白質(zhì)，這與ProtParam的預(yù)測結(jié)果一致。

圖3 AcFLS蛋白親疏水性分析

2.3 AcFLS蛋白結(jié)構(gòu)域分析

通過NCBI Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，AcFLS蛋白的保守功能域預(yù)測如圖4所示，該蛋白包含3個(gè)功能域，其中1～309氨基酸為PLN02704超級家族結(jié)構(gòu)域，該功能域?yàn)辄S酮醇合成酶功能域，說明其具有黃酮醇合成酶的功能。此外，184～282氨基酸為一個(gè)2OG－Fe(Ⅱ)－Oxy功能域，屬于2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶家族，27～301氨基酸為一個(gè)PcbC超級家族功能域，表明AcFLS蛋白屬于α－同戊二酸依賴性雙加氧酶超家族。

圖4 AcFLS蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.4 AcFLS蛋白同源性分析

利用Blastp對AcFLS氨基酸序列進(jìn)行同源檢索，發(fā)現(xiàn)AcFLS蛋白氨基酸序列與已報(bào)道洋蔥FLS蛋白(登錄號(hào):AQR58516.1)同源性最高，為91.34%，與同為百合科的虎眼萬年青FLS蛋白(登錄號(hào):QBQ58059.1)的同源性為76.42%，與石刁柏FLS蛋白(登錄號(hào):XP＿020241901.1)的同源性為74.63%。進(jìn)一步說明克隆得到的為洋蔥FLS基因。

通過DNAMAN將AcFLS基因完整開放閱讀框編碼的氨基酸序列與其它植物FLS氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明AcFLS蛋白氨基酸序列與其它植物FLS氨基酸序列同源性平均值為82.16%，并且具有相似的保守域，特別是紅色方框標(biāo)注的2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶結(jié)構(gòu)域，在不同植物中具有高度同源的氨基酸序列，該功能域含有3個(gè)高度保守的氨基酸序列，分別為與亞鐵離子結(jié)合的H－X－D、H－X序列以及與2－酮戊二酸結(jié)合的R－X－S序列(X代表任意氨基酸，圖5)。

圖5 不同植物FLS蛋白氨基酸序列比對分析

2.5 AcFLS蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位

SOPMA(http://npsa－pbil.ibcp.fr/cgi－bin/npsa＿automat.pl?page＝npsa＿sopma.html)在線預(yù)測分析結(jié)果顯示(圖6)，AcFLS蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲、α－螺旋、延伸鏈和β－折疊結(jié)構(gòu)，占比分別為46.28%、28.16%、20.06%和5.50%，說明AcFLS蛋白是由多種元件組成的混合結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)。利用在線工具SWISS－MODEL得到AcFLS蛋白的三級結(jié)構(gòu)，一致度為45.45%，GMQE值為0.84，可信度接近1，表明所建模型的可靠度較高(圖7)。

圖6 AcFLS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

圖7 AcFLS蛋白三級結(jié)構(gòu)模擬圖

利用ProtComp 9.0在線預(yù)測AcFLS蛋白的亞細(xì)胞定位，分析結(jié)果表明該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的積分值高達(dá)8.67(圖8)，推斷AcFLS蛋白極大可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖8 AcFLS蛋白亞細(xì)胞定位

2.6 AcFLS基因表達(dá)分析

以β－Actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對紫皮、黃皮洋蔥鱗莖膨大前根、葉鞘、葉片及鱗莖膨大各時(shí)期AcFLS基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，AcFLS基因在洋蔥不同組織部位的表達(dá)存在明顯差異，葉鞘中表達(dá)量最高，葉片次之，根中表達(dá)量極少(圖9)；AcFLS基因在洋蔥鱗莖不同膨大時(shí)期的相對表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，在鱗莖膨大盛期達(dá)到最高值(圖10)。但是，無論不同組織部位還是鱗莖不同膨大時(shí)期，紫皮和黃皮洋蔥中AcFLS基因的表達(dá)水平并無顯著差異。

圖9 AcFLS基因在不同皮色洋蔥不同組織中的相對表達(dá)量

圖10 AcFLS基因在不同皮色洋蔥鱗莖膨大各時(shí)期的相對表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

目前在眾多植物中的研究表明，F(xiàn)LS基因與黃酮醇的合成和積累直接相關(guān)，并且能夠影響植物花青素的生物合成和積累，F(xiàn)LS是黃酮類化合物合成代謝下游的關(guān)鍵酶，不同植物的FLS具有較高的保守性，其中比較典型的保守序列是RX－S、H－X和H－X－D序列[20－22]。本研究克隆了洋蔥FLS基因編碼序列，通過分析其編碼蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)與其它植物FLS蛋白氨基酸序列的同源性為82.16%，AcFLS蛋白還包含F(xiàn)LS家族成員的大部分特征，比如包含2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶結(jié)構(gòu)域、PcbC超級家族功能域以及2OG－Fe(Ⅱ)結(jié)構(gòu)域中與亞鐵離子結(jié)合的H－X－D、H－X序列和與2－酮戊二酸結(jié)合的R－X－S序列。這與在蘋果、紫山藥和羅布麻[23－25]中FLS蛋白的分析結(jié)果一致，說明FLS家族蛋白的氨基酸序列保守性較高，特別是一些涉及蛋白功能的位點(diǎn)，保證了FLS基因在不同物種間生物學(xué)功能的穩(wěn)定性。

實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析結(jié)果表明，AcFLS基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，表現(xiàn)為葉鞘中表達(dá)量最高，葉片次之，根中表達(dá)量極低；AcFLS基因在洋蔥鱗莖膨大期的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在鱗莖膨大盛期達(dá)到最高值。這與葡萄風(fēng)信子MaFLS基因的表達(dá)模式相似，MaFLS基因在花中的表達(dá)強(qiáng)度最高，其次是葉，根和莖中表達(dá)量最低[26]。在葉鞘和鱗莖中AcFLS基因表達(dá)量高，推測這可能是因?yàn)轺[莖(葉鞘)為營養(yǎng)儲(chǔ)藏器官，需要積累大量黃酮醇類化合物；同時(shí)在葉片中也檢測到AcFLS基因的表達(dá)，可能是葉片中合成黃酮醇類化合物以抵御太陽輻射等非生物脅迫的危害。本研究還發(fā)現(xiàn)AcFLS基因在紫皮和黃皮洋蔥中的表達(dá)量并無顯著差異，這與Park等[18]的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)辄S酮醇類化合物是洋蔥正常生長發(fā)育的重要物質(zhì)，也是其抗逆、抗脅迫應(yīng)答機(jī)制的重要組成成分，在不同皮色洋蔥中均需要一定數(shù)量黃酮醇類物質(zhì)的存在；而且植物黃酮醇的合成不僅與FLS基因的表達(dá)有關(guān)，同時(shí)還受UV－B、光等多種環(huán)境因素的影響[27]。

FLS基因是影響植物花青素合成和積累的重要基因，本研究克隆了洋蔥FLS基因，并對其氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)研究了不同皮色洋蔥中FLS基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究洋蔥FLS的生物學(xué)功能以及洋蔥鱗莖顏色產(chǎn)生的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步弄清洋蔥鱗莖顏色產(chǎn)生的機(jī)制，下一步需克隆洋蔥MBW轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及顏色抑制基因I和基本顏色基因C，同時(shí)研究花青素合成途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況以及類黃酮的種類和含量。