趙雙枝宋國賓裘紀瑩張彥昊陳蕾蕾李熙文周慶新袁瑋楊金玉

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100；3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250014)

牛蒡(Arctium lappaL.)是菊科牛蒡?qū)賰赡晟荼局备愔参?，又名“蝙蝠刺”“蒡翁菜”“東洋牛鞭菜”等。牛蒡喜生長在光照強、土壤深厚疏松、氣候溫潤潮濕的地方[1，2]。我國大部分地區(qū)均有種植，栽培區(qū)域主要在山東、江蘇、浙江、湖北、安徽、甘肅等地區(qū)[3]。牛蒡富含菊糖、蛋白質(zhì)、鈣等營養(yǎng)成分及多種維生素、17種氨基酸，有較高的藥用和食用價值[4，5]。牛蒡葉、子、根均可作藥用[6，7]。牛蒡葉具有抗炎、疏風(fēng)散熱、抗病毒等作用[8，9]；牛蒡子具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)活性等[10，11]；牛蒡根的主要功效包括降脂、調(diào)節(jié)胃腸功能及提高機體代謝率等[12，13]。

近年來，國外對我國牛蒡根的需求量逐漸增加，但在對外出口的牛蒡根中會產(chǎn)生約10 t/hm2的不合格產(chǎn)品，主要作為廢棄物處理[14]；同時，在我國牛蒡根精深加工過程中會產(chǎn)生大量的下腳料。為提高經(jīng)濟價值、避免資源浪費與環(huán)境污染，牛蒡根下腳料的綜合利用與開發(fā)具有深遠意義。研究不同產(chǎn)地牛蒡根下腳料的化學(xué)成分組成，旨在篩選出適合赤芝發(fā)酵的培養(yǎng)基質(zhì)，通過赤芝－牛蒡根下腳料雙向發(fā)酵體系的建立，提高發(fā)酵菌質(zhì)某些營養(yǎng)成分、功效成分及風(fēng)味，以期開發(fā)出功能性牛蒡靈芝茶等飲品，既可解決牛蒡下腳料廢棄、腐爛引起的資源浪費和環(huán)境污染問題，又可提高該資源經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

牛蒡根下腳料分別從山東安丘、江蘇徐州、安徽亳州、山東蘭陵、甘肅隴南及山東青島城陽地區(qū)農(nóng)戶手中采集，是牛蒡根加工過程中產(chǎn)生的破碎料、殘根、碎屑等廢棄物，經(jīng)清洗、切碎后于65℃烘箱烘干備用。赤芝(Ganoderma lucidum)菌種CICC 50006由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)研究所食品微生物團隊分離、保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化和種子培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌30 min后制成試管斜面?zhèn)溆?。無菌條件下剖取小塊母種(1 cm2)，移接到斜面活化培養(yǎng)基，27℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面后置于4℃保存?zhèn)溆?。種子培養(yǎng)基為20%土豆汁、3%麥麩、3%葡萄糖、0.2%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂，自然pH。

1.2.2 牛蒡根下腳料預(yù)處理及發(fā)酵 將牛蒡根下腳料水中浸泡2 h，利用脫水機脫水，水分含量控制在65%，按300 g/袋裝袋，121℃滅菌2 h。赤芝接種量為10%，發(fā)酵溫度為26℃，分別于培養(yǎng)第7、10、13、16、19天取樣，粉碎后測定營養(yǎng)和功效成分。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選 檢測安丘、徐州、亳州、蘭陵、隴南、城陽6個地區(qū)牛蒡根下腳料中氨基酸總量、蛋白質(zhì)、類黃酮、總糖、還原糖、菊糖、總?cè)扑帷⒑塑?、揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量以及抗氧化活性。綜合赤芝菌生物學(xué)特性及對主要營養(yǎng)物質(zhì)的需求，篩選出最優(yōu)的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。

1.2.4 營養(yǎng)成分和功能成分測定 蛋白質(zhì)含量:將烘干后的樣品粉碎，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》(凱氏定氮法)。

氨基酸含量:將烘干、粉碎后的樣品進行鹽酸酸解，參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

多糖含量:精密稱取烘干、粉碎均勻樣品1 g于具塞試管中，加入25 mL純水，沸水浴提取2 h，冷卻過濾后殘渣用20 mL純水再提取1 h，合并濾液，定容至50 mL，充分搖勻。采用苯酚硫酸法，參照劉夕娟等[15]的試驗方法進行測定。

還原糖含量:采用DNS試劑法，參照劉夕娟等[15]的試驗方法進行測定。

菊糖含量:根據(jù)總糖和還原糖標準曲線分別計算樣品中兩者的含量，然后根據(jù)公式計算菊糖含量。菊糖含量＝總糖含量－還原糖含量。

總?cè)扑岷?參照劉超[16]的方法進行測定。精密稱取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL齊墩果酸標準品溶液于8支具塞試管中，水浴加熱揮發(fā)掉溶劑；分別向每支試管中加5%香草醛－冰醋酸溶液0.3 μL、高氯酸1 mL，密封；70℃水浴恒溫加熱25 min，取出后立即冰水冷卻，加冰醋酸10 μL，搖勻，550 nm處測定吸光值，以吸光度(A)為縱坐標、齊墩果酸濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，其回歸方程為A＝0.8633C，R2＝0.9991。粉碎后的樣品于40℃烘箱烘8 h，精密稱取各樣品2.0 g，放入具塞三角瓶中，加乙醇40mL，超聲30 min，過濾，濾渣加入無水乙醇30 mL，超聲30 min，過濾，用乙醇沖洗濾渣數(shù)次，濾液定容于100 mL，待測。精密吸取各供試品溶液0.2 mL，重復(fù)3次，按照上述標準曲線步驟操作測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算濃度(mg/g)。

核苷含量:參照王金艷等[17]的方法進行測定。精密稱取粉碎后均勻的樣品1 g于10 mL具塞試管中，加入10 mL蒸餾水，混勻后超聲(500W，40 kHz)提取1 h。將試管取出后冷卻至室溫，混勻，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液過0.45 μm微孔濾膜并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，進行HPLC分析，繪制核苷標準曲線，對發(fā)酵前后核苷含量進行測定。

色譜條件:色譜柱為Aglient HC－C18柱(4.6mm×250 mm，5 μm)。流動相(甲醇－水)梯度洗脫程序:0→20 min，甲醇5%，水95%；20→35 min，甲醇20%，水80%；35→36 min，甲醇5%，水95%；36→40 min，甲醇5%，水95%。紫外檢測器，波長259 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

1.2.5 揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量測定 參照屠玥之等[18]的方法進行測定。稱取各待測樣品2.00g左右于頂空瓶中，加入5 mL蒸餾水、5 μL四甲基二戊醇，混勻，于65℃條件下將65 μm PDMS/DVB纖維萃取頭插入頂空瓶中萃取30 min，拔出萃取頭插入GC－MS進樣口中，220℃脫附2 min，進行GC－MS分析，得到質(zhì)譜圖，由ChromaTOF軟件系統(tǒng)完成質(zhì)譜分析?；衔餀z索譜庫:NIST譜庫。以各揮發(fā)性組分的峰面積占總面積之比表示組分相對含量。

色譜條件:DB－Wax毛細管柱(60 m×320 μm×0.15 μm)；進樣口溫度220℃；載氣:氦氣(純度＞99.999%)；流速1 mL/min；分流進樣。升溫程序:50℃保持3 min，以3℃/min升溫至120℃并保持3 min，以5℃/min升溫至250℃并保持10 min；總分析時間為62 min。質(zhì)譜條件:離子源為EI；電離能量:－70 eV；質(zhì)量掃描范圍:33～600 u；離子源溫度:200℃；傳輸線溫度:250℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 26.0的ANOVA法進行單因子方差分析，統(tǒng)計各處理組之間的差異性，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)牛蒡根下腳料營養(yǎng)成分和功效成分測定結(jié)果

2.1.1 不同地區(qū)牛蒡根下腳料營養(yǎng)成分含量由表1可知，安丘地區(qū)牛蒡根下腳料中氨基酸總量最高，達104.0 g/kg，與亳州地區(qū)的差異不顯著，但顯著高于其它地區(qū)。安丘地區(qū)牛蒡根下腳料中蛋白質(zhì)含量最高，達117.9 g/kg，顯著高于其它地區(qū)。安丘地區(qū)牛蒡根下腳料中總糖和菊糖含量最高，分別達0.72、0.66 g/g，與隴南地區(qū)的差異不顯著，但顯著高于其它地區(qū)?？梢?，不同地區(qū)的牛蒡根下腳料中營養(yǎng)成分含量存在較大差異。

表1 不同地區(qū)牛蒡根下腳料營養(yǎng)成分含量

由表2可知，亳州、隴南地區(qū)牛蒡根下腳料均未檢出胞苷，各地區(qū)均未檢出鳥苷、肌苷及腺苷，安丘地區(qū)牛蒡根下腳料尿苷、核苷總量最高，顯著高于其它地區(qū)。

表2 不同地區(qū)牛蒡根下腳料中核苷含量(μg/g)

2.1.2 不同地區(qū)牛蒡根下腳料功效成分含量由表3可知，安丘地區(qū)牛蒡根下腳料中類黃酮含量最高，達6.72 mg/g，顯著高于其它地區(qū)。青島城陽地區(qū)總?cè)扑岷孔罡?，與蘭陵地區(qū)差異不顯著，但顯著高于其它地區(qū)。

表3 不同地區(qū)牛蒡根下腳料功效成分含量 (mg/g)

2.1.3 不同地區(qū)牛蒡根下腳料中揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量 表4表明，安丘地區(qū)牛蒡根下腳料樣品中共檢測到揮發(fā)性物質(zhì)108種，相對含量達78.47%，亳州和蘭陵樣品的總揮發(fā)性物質(zhì)種類也較多，相對含量也較高。在揮發(fā)性物質(zhì)中，醛類、氮雜環(huán)化合物、醇類、有機酸類化合物的相對含量普遍較高。安丘地區(qū)樣品中檢測到醛類化合物23種，相對含量26.35%；氮雜環(huán)化合物19種，相對含量12.76%；醇類化合物11種，相對含量7.31%；有機酸類化合物8種，相對含量10.28%；烯類化合物9種，相對含量5.57%。

表4 不同地區(qū)牛蒡根下腳料中揮發(fā)性成分種類及含量

綜上，安丘地區(qū)牛蒡根下腳料中氨基酸總量、蛋白質(zhì)含量、類黃酮含量、總糖和菊糖含量、核苷總量等營養(yǎng)和功效成分以及揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量均最高，故選擇安丘地區(qū)牛蒡根下腳料為原料制備固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，開展下一步的發(fā)酵試驗。

2.2 未發(fā)酵樣品及發(fā)酵菌質(zhì)營養(yǎng)成分、功效成分和揮發(fā)性成分組成及含量分析

2.2.1 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分含量分析 如表5所示，與未發(fā)酵樣品相比，發(fā)酵菌質(zhì)氨基酸總量顯著下降，蛋白質(zhì)含量顯著上升，說明赤芝菌絲體利用牛蒡根下腳料中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成了菌體蛋白。發(fā)酵菌質(zhì)中總糖、菊糖含量顯著降低，還原糖含量顯著升高，說明赤芝在發(fā)酵過程中能分解牛蒡根下腳料中的糖類，以滿足自身生長繁殖需要，并且進行生物轉(zhuǎn)化。

表5 牛蒡根下腳料發(fā)酵前后營養(yǎng)成分含量比較

如圖1所示，未發(fā)酵樣品中不含鳥苷、肌苷、腺苷，經(jīng)過發(fā)酵合成了上述核苷。未發(fā)酵樣品胞苷、尿苷及核苷總量較低，發(fā)酵后顯著性增加(P＜0.05)，核苷總量達到2 637.14 μg/g。

圖1 牛蒡根下腳料赤芝發(fā)酵前后核苷含量

2.2.2 發(fā)酵前后功效成分含量分析 如圖2所示，與未發(fā)酵樣品相比，牛蒡根下腳料赤芝發(fā)酵菌質(zhì)中總?cè)扑岷匡@著提高(P＜0.05)，其中發(fā)酵第13、16天含量最高，說明牛蒡根下腳料赤芝發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生三萜酸類化合物。發(fā)酵前樣品中類黃酮含量為6.72 mg/g，發(fā)酵后未檢測出。

圖2 牛蒡根下腳料發(fā)酵前后總?cè)扑岷?/p>

2.2.3 發(fā)酵前后揮發(fā)性成分組成及含量分析由表6可以看出，發(fā)酵第16天菌質(zhì)中總揮發(fā)性成分種類由未發(fā)酵樣品中的108種減少到73種，但總揮發(fā)性成分的相對含量由78.47%增加到162.21%，說明經(jīng)過發(fā)酵可去除原料本身的某些揮發(fā)性成分，同時賦予其更濃郁的香味，尤其是醛類、酮類和氧雜環(huán)類化合物的相對含量大幅提高。

表6 未發(fā)酵樣品和發(fā)酵菌質(zhì)中揮發(fā)性成分種類及其含量

3 討論

牛蒡根中含有類黃酮、三萜酸類、核苷等多種小分子功效成分[19]，還具有醇、烯、醛、酮、酚、烷烴、有機酸、酯、氮雜環(huán)及氧雜環(huán)等揮發(fā)性成分[20]。不同地區(qū)牛蒡根下腳料中蛋白質(zhì)、氨基酸、總糖、還原糖和核苷的含量差異較大。時新剛等[21]報道，山東蘭陵地區(qū)每100 g鮮牛蒡根中含有2.1 g蛋白質(zhì)。本試驗結(jié)果顯示，蘭陵地區(qū)牛蒡根下腳料中蛋白質(zhì)含量為110.5 g/kg，這可能是由于牛蒡品種、干鮮程度不同造成的。何虎翼等[22]研究證實，不同品種牛蒡根的營養(yǎng)成分差異較大。牛蒡根中氨基酸含量較高，約占干重的28%，其中精氨酸含量最高[23]。胡喜蘭等[24]研究發(fā)現(xiàn)，新疆伊犁、石河子兩個地區(qū)牛蒡根(干料)的氨基酸總量基本相同，分別為112.0、123.9 g/kg，與本試驗中安丘地區(qū)樣品相近，這表明牛蒡根下腳料含有較高的氨基酸，具有較高的再利用價值。徐孝梁等[25]研究表明，牛蒡根中菊糖含量與年均溫和土壤有機質(zhì)含量無明顯相關(guān)性，與年日照量存在正相關(guān)關(guān)系，與年降水量和年相對濕度存在負相關(guān)性。

赤芝作為木腐真菌，菌絲體活力較高，分解能力較強。牛蒡根下腳料經(jīng)過赤芝發(fā)酵后，氨基酸總量顯著降低，可能是由于赤芝菌在生長過程中利用牛蒡根下腳料中的氨基酸成分，以滿足自身生長，同時轉(zhuǎn)化合成其它物質(zhì)，從而造成了氨基酸總量的降低。高文庚等[26]對靈芝發(fā)酵粉基質(zhì)進行優(yōu)化，使氨基酸質(zhì)量分數(shù)增加了7%，與本試驗結(jié)果有一定差異，可能是本試驗發(fā)酵過程中沒有外源營養(yǎng)物質(zhì)添加的原因。有研究報道采用靈芝－牛蒡根發(fā)酵后，菌質(zhì)蛋白質(zhì)含量顯著升高[27]；采用靈芝－枇杷葉發(fā)酵后，菌質(zhì)總蛋白平均增長率為43.60%[28]。這與本試驗結(jié)果一致，可能是因為發(fā)酵過程中赤芝菌絲體生長產(chǎn)生了新的菌體蛋白。在本試驗中，發(fā)酵后總糖和菊糖顯著降低，核苷總量顯著升高，且合成了新的腺苷，與張命龍等[27]的結(jié)論一致。發(fā)酵后還原糖含量升高，這可能是由于赤芝菌絲體分解總糖生成還原糖。表明牛蒡根下腳料經(jīng)赤芝菌絲體發(fā)酵后營養(yǎng)成分發(fā)生了較大改變，體現(xiàn)了真菌發(fā)酵牛蒡根下腳料的雙向效果。

類黃酮化合物普遍存在于植物體內(nèi)的生物合成途徑中，而且可產(chǎn)生極其豐富的次生代謝物[29]，因具有清除自由基、抑菌等多種功能而受到廣泛關(guān)注。在本試驗發(fā)酵菌質(zhì)中未檢測出類黃酮物質(zhì)，而未發(fā)酵樣品中類黃酮含量為6.72 mg/g，說明發(fā)酵后類黃酮含量顯著降低，這與前人的研究結(jié)果一致[28]，表明類黃酮物質(zhì)可能在牛蒡根下腳料－赤芝發(fā)酵過程中被赤芝菌絲體代謝利用轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，今后需進一步探究其轉(zhuǎn)化機制。三萜酸類化合物廣泛存在，枇杷葉、茯苓、牛蒡根中都含有三萜酸成分，是赤芝的主要生理活性成分，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒等功能[30]。本試驗中，未發(fā)酵基質(zhì)中總?cè)扑岷繕O低，僅為0.09 mg/g，發(fā)酵第16天菌質(zhì)中總?cè)扑岷孔罡?，?.23 mg/g，這說明赤芝菌絲體可能通過生物轉(zhuǎn)化機制，利用牛蒡根下腳料中的營養(yǎng)物質(zhì)、活性物質(zhì)等合成三萜類化合物，也與前人研究結(jié)果[31]一致。

本試驗中，牛蒡根下腳料經(jīng)過赤芝菌絲體發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)種類減少，但總成分相對含量顯著提升。

4 結(jié)論

本研究中山東安丘地區(qū)牛蒡根下腳料的氨基酸、蛋白質(zhì)、總糖、菊糖、核苷、類黃酮含量及揮發(fā)性物質(zhì)種類和相對含量高于其它產(chǎn)區(qū)，適合作為赤芝發(fā)酵的固態(tài)基質(zhì)。牛蒡根下腳料經(jīng)過赤芝固態(tài)發(fā)酵，明顯提高了菌質(zhì)的營養(yǎng)成分和功效成分含量，同時去除了難聞、刺鼻氣味，更好地呈現(xiàn)了愉悅的香味，為牛蒡根下腳料的綜合利用和功能性牛蒡靈芝茶飲品的開發(fā)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。