陳志偉劉靜嫻宮文萍韓冉李豪圣劉建軍賈舉慶劉成

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/小麥玉米國(guó)家工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省小麥技術(shù)創(chuàng)新中心/濟(jì)南市小麥遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 泰安 271018)

小麥(Triticum aestivumL.)是世界上種植面積最大的糧食作物，養(yǎng)活了世界上超過(guò)1/3的人口[1]。在我國(guó)，小麥?zhǔn)堑诙蠹Z食作物，產(chǎn)量約占糧食總產(chǎn)量的22%[2]。然而，在小麥遺傳改良過(guò)程中，由于長(zhǎng)期的品種間雜交選育，育成的小麥品種的遺傳基礎(chǔ)越來(lái)越狹窄，對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性下降甚至喪失，制約著小麥產(chǎn)量的進(jìn)一步提高[3]。野生近緣物種是小麥抗病抗逆育種的優(yōu)異基因源，通過(guò)雜交將其優(yōu)良性狀導(dǎo)入小麥，可以豐富小麥的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)提高小麥育種水平具有重要意義[3，4]。

智利大麥(Hordeum chilense，2n＝2x＝14，HchHch)是一年生野生種，主要分布于南美洲的智利、阿根廷等地[5]，其基因組內(nèi)含有抗白粉病、葉銹病、稈銹病、全蝕病和穎枯病等的抗病基因[6，7]及抗干旱脅迫和鹽脅迫等的抗逆基因[8，9]，是小麥育種優(yōu)異基因的潛在來(lái)源[10]。蔣繼明等[11]將智利大麥與小麥雜交并進(jìn)行染色體加倍獲得了小麥－智利大麥雙二倍體，通過(guò)與小麥回交自交獲得一批小麥－智利大麥附加系和代換系等珍貴材料，為后續(xù)智利大麥優(yōu)異基因的定位與利用奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，分子標(biāo)記輔助育種越來(lái)越被育種家們接受并應(yīng)用。SCAR、SSR及KASP等[12]標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于追蹤和選擇目標(biāo)基因以及前景選擇和背景選擇[13，14]，大大縮短了育種年限，降低了育種成本，提高了育種效率。研究表明，禾本科物種的基因序列有較高的保守性[15]，可以根據(jù)已測(cè)序物種的基因序列開(kāi)發(fā)引物來(lái)建立未測(cè)序物種的分子標(biāo)記[16，17]。基于此，PLUG引物[18]和IT引物[19]應(yīng)運(yùn)而生，并被用于小麥背景下遠(yuǎn)緣物種染色體分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)[14]。本研究利用PLUG引物和IT引物對(duì)中國(guó)春－智利大麥雙二倍體及對(duì)照小麥中國(guó)春進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選能擴(kuò)增出多態(tài)性片段的引物，對(duì)一套中國(guó)春－智利大麥附加系進(jìn)行擴(kuò)增，定位相關(guān)多態(tài)性片段，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)附加系與小麥雜交后代進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證標(biāo)記可用性，從而為小麥背景中智利大麥染色質(zhì)的追蹤提供新的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥中國(guó)春(Chinese Spring，CS)由電子科技大學(xué)楊足君教授提供。中國(guó)春－智利大麥雙二倍體(CS－Hchamp)由英國(guó)約翰英納斯中心(John Innes Centre，JIC)的Reader S.M.教授提供。CS－智利大麥2HchS端體附加系(TA7587)、CS－智利大 麥4Hch附 加 系(TA7588)、5Hch附 加 系(TA7589)、6Hch附加系(TA7590)以及7Hch附加系(TA7591)由美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與基因資源中心(Wheat Genetic and Genomic Resources Center，WGGRC)的Gill B.S.教授提供。濟(jì)麥22(JM22)、濟(jì) 麥23(JM23)、濟(jì) 麥262(JM262)、濟(jì)麥229(JM229)、濟(jì)麥38(JM38)和濟(jì)麥44(JM44)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥遺傳育種團(tuán)隊(duì)培育。CZW1—CZW96是CS－智利大麥2HchS端體附加系/CS的雜交F2后代，CZW97—CZW192是CS－智利大麥4Hch附加系/CS的雜交F2后代，CZW193—CZW288是CS－智利大麥5Hch附加系/CS的雜交F2后代。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取。稱(chēng)取約100 mg的葉片放入2mL離心管(提前加入直徑2 mm的鋼珠)中，液氮中速凍3 min，然后用SCIENTZ－192組織研磨機(jī)在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末，提取方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。

1.2.2 IT引物的PCR擴(kuò)增及電泳 IT引物序列參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。PCR擴(kuò)增程序:預(yù)變性94℃3min；變性94℃45 s，退火57℃45 s，延伸72℃1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；充分延伸72℃10 min，4℃保存。706對(duì)IT引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成，其中，染色體第二到第七同源群各175、120、89、140、71、111對(duì)。IT－PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳后，在紫外凝膠成像儀GDSGel Dol 2000下掃描照相。

1.2.3 PLUG引物的PCR擴(kuò)增及電泳 PLUG引物序列參照文獻(xiàn)[14]，PCR擴(kuò)增程序同IT引物。477對(duì)PLUG引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成，其中，染色體第二到第七同源群各66、83、80、86、54、108對(duì)。未經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切、經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ或TaqⅠ酶切的PLUG－PCR產(chǎn)物分別在2%瓊脂糖凝膠中電泳后，在紫外凝膠成像儀GDS－Gel Dol 2000下掃描照相。

酶切體系(15 μL):酶0.2 μL，Buffer 1.5 μL，ddH2O 4.5 μL、PCR產(chǎn)物8.8 μL。酶切程序:TaqⅠ65℃2 h，HaeⅢ37℃2 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 用于PCR穩(wěn)定擴(kuò)增的引物篩選

用477對(duì)PLUG引物對(duì)中國(guó)春和中國(guó)春－智利大麥雙二倍體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，309對(duì)引物可以在供試材料中擴(kuò)增出清晰明顯的DNA條帶，占總引物比約為64.8%；每對(duì)PLUG引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)量為1～7條，擴(kuò)增出的片段大小為170～2 000 bp。上述309對(duì)引物中，能在供試材料中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的，用一套小麥－智利大麥附加系進(jìn)行擴(kuò)增定位多態(tài)性標(biāo)記所在染色體；不能直接擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的，利用限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ和TaqⅠ對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，能酶切出多態(tài)性的，再用一套小麥－智利大麥附加系進(jìn)行擴(kuò)增后酶切定位多態(tài)性標(biāo)記所在染色體。

用706對(duì)IT引物對(duì)中國(guó)春和中國(guó)春－智利大麥雙二倍體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，670對(duì)引物可以在供試材料中擴(kuò)增出清晰明顯的DNA條帶，占總引物比約為94.9%；每對(duì)IT引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為1～4條，擴(kuò)增出的片段大小為100～2 000 bp。這670對(duì)引物中，能在供試材料中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的，再用一套小麥－智利大麥附加系進(jìn)行擴(kuò)增定位多態(tài)性標(biāo)記所在染色體。

2.2 智利大麥特異PLUG和IT標(biāo)記的篩選

為了篩選智利大麥染色體特異性引物，我們利用中國(guó)春和中國(guó)春－智利大麥雙二倍體對(duì)上述引物進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，98對(duì)PLUG引物可在中國(guó)春與中國(guó)春－智利大麥雙二倍體間擴(kuò)增或擴(kuò)增/酶切出多態(tài)性條帶，其中，TNAC1061、TNAC1063和TNAC1066等引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖1A所示。37對(duì)IT引物可在中國(guó)春與中國(guó)春－智利大麥雙二倍體間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，其中，CINAU1115、CINAU1116和CINAU1119等引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖1B所示。

圖1 PLUG引物和IT引物在中國(guó)春和中國(guó)春－智利大麥雙二倍體中的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 智利大麥染色體特異性PLUG和IT標(biāo)記的建立

為了明確上述智利大麥特異性標(biāo)記所在的染色體，我們利用這37對(duì)IT引物和98對(duì)PLUG引物對(duì)中國(guó)春、中國(guó)春－智利大麥附加系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，CINAU1093、CINAU1101和CINAU1121等17對(duì)IT引 物 以 及TNAC1240、TNAC1510和TNAC1326等38對(duì)PLUG引物能在小麥－智利大麥附加系中擴(kuò)增出多態(tài)性片段，其中，有4對(duì)引物僅在智利大麥的2Hch染色體上擴(kuò)增出特異性條帶，20對(duì)引物僅在4Hch染色體上擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，29對(duì)引物僅在5Hch染色體上擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，CINAU1217引物能同時(shí)在2Hch、4Hch和5Hch染色體上擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，CINAU1187能同時(shí)在4Hch和5Hch染色體上擴(kuò)增出多態(tài)性條帶。因此，本研究共計(jì)獲得智利大麥染色體特異分子標(biāo)記55個(gè)(表1)。引物CINAU1121和TNAC1510的擴(kuò)增結(jié)果分別如圖2A、B所示。

圖2 引物CINAU1121和TNAC1510在供試材料中的擴(kuò)增結(jié)果

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.4 智利大麥PLUG和IT標(biāo)記的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證建立的智利大麥染色體特異分子標(biāo)記的可用性，利用篩選到的2Hch、4Hch和5Hch染色體特異引物(表1)分別對(duì)CS－智利大麥2HchS端體附加系/CS的雜交F2后代CZW1—CZW96、CS－智利大麥4Hch附加系/CS的雜交F2后代CZW97—CZW192以及CS－智利大麥5Hch附加系/CS的雜交F2后代CZW193—CZW288進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述引物均能在相應(yīng)附加系/CS雜交后代中擴(kuò)增出目標(biāo)多態(tài)性條帶，說(shuō)明這些標(biāo)記可用于檢測(cè)小麥背景中的智利大麥染色質(zhì)。其中，引物CINAU1121在CZW1—CZW24的擴(kuò)增結(jié)果如圖3A所示，引物TNAC1615在CZW197—CZW220的擴(kuò)增結(jié)果如圖3B所示。

3 討論與結(jié)論

智利大麥對(duì)小麥遺傳改良具有重要意義，因此多個(gè)智利大麥染色體特異標(biāo)記得到建立。Hernández等[20]利用RAPD引物建立了11個(gè)可以用于鑒定小麥背景中智利大麥染色質(zhì)的STS標(biāo)記；Castillo等[21]利用EST－SSR引物建立了21個(gè)可用于對(duì)智利大麥多態(tài)性分析以及小麥標(biāo)記輔助導(dǎo)入育種的EST－SSR標(biāo)記。Said和Cabrera[22]利用SSR引物和STS引物建立了智利大麥8個(gè)SSR標(biāo)記和4個(gè)STS標(biāo)記；Mattera等[23]利用EST和COS引物建立了智利大麥特異性標(biāo)記60個(gè)；陳志偉等[24]利用染色體第一同源群的PLUG引物和IT引物建立了智利大麥1HchL染色體的PLUG標(biāo)記和IT標(biāo)記各1個(gè)。但這對(duì)于智利大麥的染色體物理圖譜構(gòu)建和基因精細(xì)定位還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。鑒于此，本研究開(kāi)展了智利大麥染色體特異性分子標(biāo)記的建立，共建立智利大麥染色體特異分子標(biāo)記55個(gè)，包括38個(gè)PLUG標(biāo)記和17個(gè)IT標(biāo)記，為鑒定小麥背景中智利大麥染色體提供了新的檢測(cè)手段。

研究證明，PLUG引物和IT引物可以應(yīng)用于小麥近緣物種染色體特異性標(biāo)記的建立[3，14，17]。然而，利用這兩種引物建立智利大麥分子標(biāo)記的報(bào)道卻比較少見(jiàn)。本研究利用上述兩種引物建立了智利大麥染色體特異PLUG標(biāo)記38個(gè)和IT標(biāo)記17個(gè)，標(biāo)記獲得率分別為8.0%和2.4%，低于PLUG引物在帝國(guó)黑麥、多年生簇毛麥和無(wú)芒山羊草中的標(biāo)記獲得率54.9%[25]、41.7%[26]和6.9%[27]，也低于IT引物在無(wú)芒山羊草以及簇毛麥中的標(biāo)記獲得率21.5%[27]和51.8%[19]。利用PLUG和IT引物建立智利大麥染色體特異標(biāo)記獲得率低的原因可能是智利大麥與小麥的親緣關(guān)系相對(duì)小麥與山羊草、黑麥和簇毛麥遠(yuǎn)，上述猜測(cè)得到了來(lái)自物種5S RNA短間隔序列、5S RNA長(zhǎng)間隔序列以及ITS序列分別對(duì)小麥族物種進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果的支持[28]。

智利大麥染色體上擁有小麥育種所需的優(yōu)異基因[29－31]，其中，4Hch染色體上具有抗小麥葉枯病基因，4Hch和5Hch染色體上具有耐鹽基因。本研究建立的55個(gè)特異分子標(biāo)記中50個(gè)被定位到4Hch或5Hch染色體上，其實(shí)用性也經(jīng)過(guò)相應(yīng)雜交分離群體進(jìn)行了驗(yàn)證，因此，可通過(guò)這些標(biāo)記輔助從相應(yīng)雜交分離群體后代材料中選擇鑒定耐鹽或抗葉枯病的小麥－智利大麥4Hch和5Hch染色體系。目前，筆者正在利用建立的智利大麥染色體特異分子標(biāo)記結(jié)合熒光原位雜交以及耐鹽和葉枯病表型調(diào)查對(duì)小麥－智利大麥雜交后代材料CZW97—CZW288進(jìn)行鑒定。