許珍珍,蔣新怡,石蘇可,呂志強(qiáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

microRNA(miRNA)是一類非編碼RNA，長約22 nt，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，對真核生物的生長發(fā)育至關(guān)重要(Bartel,2009;Jaubertetal.,2010;Pasquinelli,2012)。研究表明，miRNA及其通路中的組分與昆蟲的先天性免疫有關(guān)(Sabinetal.,2009;Asgari,2013;Wangetal.,2021)。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的miR-958靶向Toll通路中的Toll和Dif基因，降低下游抗菌肽基因Drosomycin的表達(dá)(Lietal.,2017)。斯氏按蚊Anophelesstephensi體內(nèi)let-7和miR-100可靶向球孢白僵菌Beauveriabassiana的sec2p和C6TF，降低其表達(dá)，抑制真菌毒力(Wangetal.,2021)。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera在干擾Dicer-1和Ago-1后，更容易受到細(xì)菌的侵染(Baradaranetal.,2019)。

Dicer-1是miRNA產(chǎn)生過程中一個重要的內(nèi)切酶，屬于RNaseⅢ家族，它可將pre-miRNA剪切并轉(zhuǎn)化為成熟的miRNA(Niuetal.,2017)。沙漠蝗Schistocercagregaria的Dicer-1包括1個DEAD解螺旋域(DEAD-like helicase domain,DEXDc)、1個C端解螺旋域(helicase,HELI)、1個Dicer二聚化結(jié)構(gòu)域、1個PAZ結(jié)構(gòu)域、2個RNase III結(jié)構(gòu)域和1個dsRNA結(jié)合基序(Wynantetal.,2015)。Dicer-1對昆蟲的許多生物學(xué)過程具有重要意義。抑制飛蝗Locustamigratoria的Dicer-1導(dǎo)致若蟲到若蟲以及若蟲到成蟲的蛻皮不能正常進(jìn)行(Wangetal.,2013)。沉默棉鈴蟲的Dicer-1基因?qū)е耺iRNA合成受到抑制，miRNA的表達(dá)降低，成蟲發(fā)育出現(xiàn)畸形，死亡率升高(Rahimpouretal.,2019)。

Argonaute-1(Ago-1)蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducing silencing complex,RISC)的核心成分，該復(fù)合物包含Ago和PIWI蛋白亞類。橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis的Ago-l包含DUF1785結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域(Yangetal.,2021)。Ago-1和Ago-2是Ago蛋白亞類的兩個成員，它們在小RNA導(dǎo)向的RNA切割途徑中有不同的作用。Ago-1是miRNA通路中RISC的主要成分，參與miRNA通路，而Ago-2主要與siRNA通路相關(guān)(Okamuraetal.,2004)。

Dicer-1和Ago-1是miRNA通路中的兩個關(guān)鍵組分，昆蟲體內(nèi)Dicer-1和Ago-1的缺失會導(dǎo)致其miRNA表達(dá)異常(Maetal.,2017;Rahimpouretal.,2019;Yangetal.,2021)。與其他被廣泛研究的模式昆蟲相比，豌豆蚜Acyrthosiphonpisum具有相對有限的免疫系統(tǒng)(Gerardoetal.,2010)，但其體內(nèi)的miRNA合成及作用通路是完整的(International Aphid Genomics Consortium,2010)。而且，研究表明miRNA及其通路中相關(guān)因子與昆蟲抵御病原物侵染的免疫防御反應(yīng)有關(guān)(Baradaranetal.,2019;Maetal.,2020)。因此，本研究檢測了豌豆蚜感染細(xì)菌和真菌后Dicer-1和Ago-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，并分析了沉默Dicer-1和Ago-1對豌豆蚜體內(nèi)細(xì)菌和真菌增殖以及豌豆蚜存活率的影響。本研究明確了miRNA通路中兩個關(guān)鍵組分Dicer-1和Ago-1在豌豆蚜抵御病原物侵染的免疫防御反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究所用的豌豆蚜采自中國云南省，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)種群由單頭成蚜孤雌生殖產(chǎn)生，飼養(yǎng)條件如下：溫度20±1℃、相對濕度70%±5%、光周期16L∶8D。取15頭左右健康成蚜接于盆栽的蠶豆苗上，并用透明塑料罩將蠶豆苗罩住，塑料罩頂端用細(xì)的尼龍網(wǎng)紗布封口，約24 h后將蠶豆苗上成蚜全部移除，留下所產(chǎn)的若蚜，繼續(xù)飼養(yǎng)直至其發(fā)育為無翅成蚜，飼養(yǎng)期間每天清潔蜜露和蛻掉的皮，并定期給蠶豆苗澆水。

1.2 細(xì)菌和真菌侵染

侵染所用的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和大腸桿菌Escherichiacoli，將菌液活化后，重新接于LB培養(yǎng)基中，37℃下240 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0，離心，收集菌體，然后用無菌0.85% NaCl溶液洗滌3次，最后將金黃色葡萄球菌懸浮至終濃度為2×1011CFU/mL，大腸桿菌為1010CFU/mL；侵染所用真菌為球孢白僵菌，將其接于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)上，27℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 d，使其充分產(chǎn)孢，洗滌菌絲，并使菌絲與孢子分離，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液濃度，最后加入0.05% Tween-20，使得孢子懸浮液終濃度為2×107孢子/mL，用于感染。

細(xì)菌侵染時將毛細(xì)玻璃管尖頭末端截為2 mm左右的斜面，平頭末端用封口膜密封，尖端蘸取菌液刺入豌豆蚜成蚜背部，大約3 s后將毛細(xì)玻璃管取出，對照組豌豆蚜成蚜用0.85% NaCl溶液；真菌侵染時吸取1 μL孢子液滴于豌豆蚜背部，對照組同樣用0.85% NaCl溶液。侵染后將成蚜繼續(xù)飼養(yǎng)于新鮮蠶豆苗上。在細(xì)菌侵染后6,12和24 h時和真菌侵染后1,2,3和4 d時，從對照組和處理組中分別取5頭成蚜至1.5 mL RNase-free 離心管，加入200 μL TRIpure Isolation Reagent (Roche,Basel,瑞士)，置于-80℃保存。侵染實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 Dicer-1和Ago-1表達(dá)的qRT-PCR檢測

將1.2節(jié)所得樣品充分研磨使其完全破碎，利用TRIpure試劑(Roche,Basel，瑞士)提取豌豆蚜成蚜總RNA。按照First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche,Basel,瑞士)說明合成cDNA。以所得cDNA為模板，根據(jù)豌豆蚜Dicer-1(GenBank登錄號:XM_001944279.4)和Ago-1(GenBank登錄號:XM_003240572.3)的基因序列，在線設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因核糖體蛋白L7(ribosomal protein L7,Rpl7)基因(GenBank登錄號:NM_001135898.1)的引物(表1)。將cDNA原液稀釋至工作液(100 ng/μL)，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，所有反應(yīng)做3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系(20 μL):2×Fast qPCR Master Mix (Biosystems) 10 μL,cDNA工作液2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸20 s,40個循環(huán)。熔解曲線溫度為65℃-95℃。

1.4 Dicer-1和Ago-1的RNAi

將1.2節(jié)所得樣品充分研磨使其完全破碎，利用TRIpure試劑(Roche,Basel,瑞士)提取豌豆蚜成蚜總RNA。按照First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche,Basel,瑞士)說明合成cDNA。以所得cDNA為模板，基于Dicer-1和Ago-1序列，利用在線工具SnapDragon (http:∥www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl)設(shè)計(jì)合成dsRNA的引物(表1)，通過PCR擴(kuò)增干擾片段，然后使用天根公司膠回收試劑盒對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，作為dsRNA合成的模板，按T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System Kit試劑盒(Promega)說明，合成dsRNA。將dsRNA稀釋至終濃度為10 μg/μL，分裝后置于-80℃超低溫冰箱保存。

參考張永棟等(2017)的方法，用CO2將豌豆蚜成蚜麻醉，在顯微注射儀下進(jìn)行dsDicer-1和dsAgo-1注射，注射濃度均為10 μg/μL，注射量為100 nL，對照組注射小鼠淋巴毒素A(Musmusculuslymphotoxin A,LTA)基因的dsLTA，注射濃度和劑量同處理組，引物序列見表1。待豌豆蚜蘇醒后，將其接于新的蠶豆苗上繼續(xù)飼養(yǎng)。在注射dsRNA后1-3 d，利用qRT-PCR檢測(同1.3節(jié))干擾效率。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 RNAi后細(xì)菌和真菌侵染豌豆蚜

收集1.4節(jié)注射dsDicer-1后48 h時和注射dsAgo-1后12 h時的豌豆蚜成蚜，進(jìn)行金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和球孢白僵菌侵染，方法同1.2節(jié)，以注射dsLTA的豌豆蚜成蚜為對照。細(xì)菌菌落形成單位(colony-forming unit,CFU)和真菌孢子數(shù)檢測：在大腸桿菌侵染后12,24和36 h時，金黃色葡萄球菌侵染后24,36和48 h時，球孢白僵菌感染后6 d時，從每組取10～20頭成蚜，放入無菌EP管中，每管1頭，用75%乙醇對豌豆蚜表面進(jìn)行消毒，用無菌的0.85% NaCl溶液清洗成蚜表面兩次后吸出溶液，加入200 μL 0.85% NaCl溶液，手動研磨，使蟲體完全被磨碎作為含菌原液，稀釋至合適濃度后吸取10 μL均勻涂于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)CFU/頭；吸取50 μL真菌溶液均勻涂于PDA固體培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)。

每組各選取20頭成蚜于健康蠶豆苗上繼續(xù)飼養(yǎng)，在侵染后1-8 d每天統(tǒng)計(jì)各組成蚜死亡數(shù)，計(jì)算存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)量的相對定量分析(Schmittgen and Livak,2008)；使用Gragpad Prism 5.0軟件作圖，采用 Student氏t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，其中死亡率結(jié)果采用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌和真菌侵染后豌豆蚜成蚜Dicer-1和Ago-1基因的表達(dá)變化

結(jié)果顯示，與對照組(0.85% NaCl溶液處理)比較，在感染金黃色葡萄球菌后12 h時豌豆蚜Dicer-1的表達(dá)量顯著上升(P<0.01)(圖1:A)，感染大腸桿菌后12和24 h時，Dicer-1的表達(dá)量略高(圖1:B)，在感染這兩種細(xì)菌后12-24 h內(nèi)，Dicer-1的表達(dá)量逐漸升高；在感染球孢白僵菌后1-3 d，Dicer-1的表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，2 d時的表達(dá)量為最高(圖1:C)。在感染金黃色葡萄球菌后24 h時Ago-1的表達(dá)量顯著高于對照組的(P<0.01)，且在12-24 h逐漸升高(圖1:D)；感染大腸桿菌后12 h時，Ago-1的表達(dá)量為最高，與對照組存在顯著差異(P<0.01)(圖1:E)；感染球孢白僵菌后1 d時Ago-1的表達(dá)量略低于對照組，2和4 d時的略高于對照組，3 d時的與對照組的相當(dāng)(圖1:F)。以上結(jié)果表明豌豆蚜Dicer-1和Ago-1的表達(dá)受到細(xì)菌及真菌侵染的誘導(dǎo)，暗示可能與豌豆蚜抵御細(xì)菌及真菌侵染有關(guān)。

圖1 細(xì)菌和真菌侵染后豌豆蚜成蚜Dicer-1(A,B,C)和Ago-1(D,E,F)的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of Dicer-1 (A,B,C) and Ago-1 (D,E,F) in Acyrthosiphon pisum adults after bacterial and fungal infectionsA,D:金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus (2×1011 CFU/mL);B,E:大腸桿菌Escherichia coli (1010 CFU/mL);C,F:球孢白僵菌Beauveria bassiana (2×107 conidia/mL).CFU:菌落形成單位Colony-forming unit.圖中數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號表示兩組間差異顯著(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)(Student氏t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE of three independent experiments.Asterisks above bars indicate significant difference between two groups (*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)(Student’s t-test).下圖同The same for the following figures.

2.2 Dicer-1和Ago-1的RNAi效率

結(jié)果顯示，在注射dsDicer-1后1-3 d，豌豆蚜成蚜體內(nèi)Dicer-1的表達(dá)量下調(diào)，且在注射后3 d時干擾效率最高，Dicer-1的表達(dá)量約為對照組(注射dsLTA)的50%，二者差異極顯著(P<0.01)(圖2:A)。在注射dsAgo-1后1 d時，豌豆蚜Ago-1基因表達(dá)量約為對照組的50%，兩組間差異極顯著(P<0.01);且在注射后2 d時仍存在一定的干擾效果，兩組間Ago-1基因表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)(圖2:B)。表明干擾導(dǎo)致目的基因表達(dá)量下降具有一定的持續(xù)性，可確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

圖2 豌豆蚜成蚜中Dicer-1(A)和Ago-1(B)的RNA干擾效率Fig.2 RNA interference efficiency of RNAi-mediated knockdown of Dicer-1 (A) and Ago-1 (B) in Acyrthosiphon pisum adults

2.3 RNAi干擾Dicer-1和Ago-1后感染細(xì)菌或真菌豌豆蚜成蚜體內(nèi)細(xì)菌和真菌的增殖

結(jié)果顯示，干擾Dicer-1后感染金黃色葡萄球菌36 h后豌豆蚜體內(nèi)的細(xì)菌菌落數(shù)(CFU/蚜蟲)顯著高于對照組(注射dsLTA)的(P<0.05)(圖3:A);感染大腸桿菌后12和24 h時豌豆蚜體內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)顯著高于對照組的(P<0.05)(圖3:B);感染球孢白僵菌后6 d時豌豆蚜體內(nèi)的孢子數(shù)顯著高于對照組的(P<0.05)(圖3:C)。在干擾Ago-1后感染金黃色葡萄球菌后36 h時豌豆蚜體內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)顯著高于對照組的(P<0.05)(圖3:D);感染大腸桿菌后24 h時豌豆蚜體內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)顯著高于對照組的(P<0.05)(圖3:E);感染球孢白僵菌后6 d時豌豆蚜體內(nèi)的孢子數(shù)顯著高于對照組的(P<0.05)(圖3:F)。

圖3 RNAi干擾Dicer-1(A,B,C)和Ago-1(D,E,F)后細(xì)菌和真菌侵染對豌豆蚜成蚜體內(nèi)細(xì)菌和真菌增殖的影響Fig.3 Effects of RNAi of Dicer-1 (A,B,C) and Ago-1 (D,E,F) followed by bacterial and fungal infections on the bacterial and fungal proliferation in Acyrthosiphon pisum adultsA,D:金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus (2×1011 CFU/mL);B,E:大腸桿菌Escherichia coli (1010 CFU/mL);C,F:球孢白僵菌Beauveria bassiana (2×107 conidia/mL).注射dsDicer-1 48 h和注射dsAgo-1 12 h后分別對豌豆蚜成蚜用1 μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和球孢白僵菌感染。圖4同。圖中每個點(diǎn)表示1頭蚜蟲。A. pisum adults were infected with 1 μL of S. aureus,E. coli and B. bassiana,respectively,at 48 h after dsDicer-1 injection and 12 h after dsAgo-1 injection.The same for Fig.4.Each dot in the figure represents one aphid.

2.4 RNAi干擾Dicer-1和Ago-1后感染細(xì)菌或真菌的豌豆蚜的存活率

結(jié)果顯示，干擾Dicer-1后豌豆蚜成蚜的存活率略低于對照組(注射dsLTA)的，但兩者無顯著差異(P>0.05)；干擾Dicer-1后感染金黃色葡萄球菌，豌豆蚜成蚜的存活率略微低于對照組，二者也無顯著差異(P>0.05)(圖4:A)。干擾Dicer-1的豌豆蚜成蚜在感染大腸桿菌后2 d時，存活率約為60%，而對照組的約為80%；感染后4 d時，處理組存活率約為40%，而對照組的大于60%；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束(7 d)時，處理組的僅有約5%存活，而對照組約有20%存活。整體生存分析表明，7 d時處理組豌豆蚜成蚜的存活率極顯著低于對照組的(P<0.001)(圖4:B)。干擾Dicer-1的豌豆蚜成蚜在感染球孢白僵菌后2 d時，存活率約為50%，對照組的約為70%；感染后4 d時，處理組存活率約為20%，而對照組的約為45%；感染后7 d時，處理組的僅有約10%存活，而對照組的約有25%存活。整體分析表明，7 d時處理組豌豆蚜成蚜的存活率顯著低于對照組的(P<0.05)(圖4:C)。

干擾Ago-1后，未感染的情況下，豌豆蚜成蚜約有42%的存活率，極顯著低于對照組的(P<0.01)；在受到金黃色葡萄球菌感染后，干擾Ago-1的豌豆蚜成蚜與對照組(注射dsLTA)豌豆蚜成蚜均在感染后5 d時全部死亡，但干擾Ago-1的豌豆蚜成蚜在感染后2 d時僅有約50%的個體存活，而對照組存活率約為75%，生存分析表明處理組與對照組之間存活率有極顯著差異(P<0.001)(圖4:D)。在干擾Ago-1后感染大腸桿菌，豌豆蚜成蚜的存活率略低于對照組的，但二者無顯著差異(P>0.05)(圖4:E)。在受到球孢白僵菌感染后7 d時，干擾Ago-1的豌豆蚜成蚜的存活率僅為40%，而對照組存活率高于70%；在7 d時，處理組豌豆蚜成蚜全部死亡，而對照組仍有約20%的個體存活，二者存在極顯著差異(P<0.001)(圖4:F)。

圖4 RNAi干擾Dicer-1和Ago-1后細(xì)菌和真菌增侵染對豌豆蚜成蚜存活率的影響Fig.4 Effect of RNAi of Dicer-1 and Ago-1 followed by bacterial and fungal infections on the survival rates of Acyrthosiphon pisum adults通過Log-rank(Mantel-Cox)方法分析感染后7 d內(nèi)的豌豆蚜成蚜存活率。星號表示侵染后7 d時兩組間存活率差異顯著(*P<0.05,**P<0.01;***P<0.001)(Student氏t檢驗(yàn))。Survival rates of the infected adults of A. pisum in 7 d were compared using Log-rank (Mantel-Cox) test.Asterisks indicate significant difference in the survival rate at 7 d post infection between two groups (*P<0.05,**P<0.01;***P<0.001)(Student’s t-test).

3 討論

生產(chǎn)實(shí)踐中，人們通常利用天敵和病原微生物對豌豆蚜進(jìn)行生物防治(潘明真等,2022)，而天敵和病原微生物會引發(fā)豌豆蚜的免疫防御反應(yīng)。研究表明miRNA及其合成過程中的多種元件參與了昆蟲抵御細(xì)菌、真菌以及病毒侵染的免疫防御過程。Baradaran等(2019)發(fā)現(xiàn)在感染蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis和馬氏沙雷菌Serratiamarcescens后，棉鈴蟲體內(nèi)Dicer-1和Ago-1的轉(zhuǎn)錄水平升高。南美白對蝦Litopenaeusvannamei與昆蟲同屬節(jié)肢動物門，在感染陶拉綜合征病毒(taura syndrome virus,TSV)后，其血細(xì)胞和鰓中Dicer-1基因的表達(dá)顯著上升，淋巴器官中Ago-1基因的轉(zhuǎn)錄水平也升高(Yaoetal.,2010)。本研究得到類似結(jié)果，在感染細(xì)菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌以及真菌球孢白僵菌后，豌豆蚜體內(nèi)Dicer-1和Ago-1基因的表達(dá)量升高(圖1)，暗示可能與豌豆蚜抵御細(xì)菌及真菌侵染有關(guān)。

在棉鈴蟲中，RNAi干擾Dicer-1使其更容易受到蘇云金芽孢桿菌和馬氏沙雷菌的侵染，細(xì)菌在體內(nèi)增殖速度更快，并且有更高的死亡率(Baradaranetal.,2019)。本研究中，RNAi干擾Dicer-1和Ago-1后感染金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，豌豆蚜體內(nèi)細(xì)菌增殖速度顯著升高(圖3)，存活率也下降(圖4)，尤其是干擾Dicer-1后感染大腸桿菌及干擾Ago-1后感染金黃色葡萄球菌，豌豆蚜的存活率顯著低于對照組(圖4)，表明豌豆蚜Dicer-1和Ago-1參與其對細(xì)菌侵染的免疫反應(yīng)，在一定程度上參與豌豆蚜抵御細(xì)菌侵染。

球孢白僵菌是一種廣泛應(yīng)用的生防真菌。本研究中，RNAi干擾Dicer-1和Ago-1后感染球孢白僵菌，豌豆蚜體內(nèi)的孢子數(shù)均顯著高于對照組(圖3:C和F)，存活率顯著低于對照組(圖4:C和F)。因此，我們認(rèn)為Dicer-1和Ago-1參與抑制入侵真菌在豌豆蚜體內(nèi)的增殖，對豌豆蚜抵御真菌侵染的免疫防御反應(yīng)具有重要作用。昆蟲miRNA可影響入侵真菌球孢白僵菌的毒力。在受到球孢白僵菌侵染后，斯氏按蚊Anophelesstephensi體內(nèi)let-7和miR-100的表達(dá)上調(diào)，靶向真菌sec2p和C6TF，抑制真菌毒力，增強(qiáng)自身免疫(Wangetal.,2021)。因此，我們推測，豌豆蚜Dicer-1和Ago-1的沉默影響了其體內(nèi)某些miRNA的生成，或阻止其生成RNA沉默誘導(dǎo)復(fù)合物，抑制其功能的發(fā)揮，而這些miRNA可能在豌豆蚜抵御真菌侵染中發(fā)揮重要作用。具體作用及調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

我們在干擾了Ago-1之后，發(fā)現(xiàn)豌豆蚜的存活率顯著低于對照組(圖4:D)。橘小實(shí)蠅Ago-1基因的下調(diào)導(dǎo)致7個表達(dá)量相對較高的miRNA差異表達(dá)，同時延緩了卵巢的發(fā)育，推測這7個差異表達(dá)的miRNA與橘小實(shí)蠅的卵巢發(fā)育有關(guān)(Yangetal.,2021)。果蠅miR-305與其壽命長短有關(guān)，果蠅體內(nèi)過表達(dá)miR-305可抑制4種抗菌肽基因和類胰島素肽基因的表達(dá)，并可能通過對這些基因的調(diào)控影響果蠅的衰老(Uedaetal.,2018)。我們推測，Ago-1蛋白作為昆蟲miRNA通路中RISC的重要組成部分，可能通過影響在豌豆蚜的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用的miRNA的產(chǎn)生，從而影響豌豆蚜的存活。干擾Ago-1對豌豆蚜生存的緩慢影響(圖4:D)也暗示了這一點(diǎn)。

RNAi是一種可持續(xù)的、環(huán)境友好的害蟲防治方法，對預(yù)防昆蟲抗藥性具有重要意義。通過RNAi抑制羧酸酯酶(carboxylesterases,CarE)基因的表達(dá)可增加抗性棉蚜Aphisgossypii對有機(jī)磷殺蟲劑氧化樂果的敏感性(Gongetal.,2014)。通過RNAi干擾Dicer-1和Ago-1導(dǎo)致棉蚜對單寧酸和棉酚有更高的敏感性，死亡率顯著高于對照組(Maetal.,2017)。在本研究中，我們的結(jié)果也表明，通過RNAi干擾Dicer-1和Ago-1后，豌豆蚜在受到細(xì)菌和真菌侵染時出現(xiàn)更高的死亡率(圖4)，表明豌豆蚜體內(nèi)miRNA通路中的兩種重要組分Dicer-1和Ago-1，可以作為未來通過病原微生物防治豌豆蚜的潛在靶標(biāo)。

總體來說，我們的研究發(fā)現(xiàn)Dicer-1和Ago-1參與豌豆蚜抵御細(xì)菌和真菌侵染的免疫防御反應(yīng)，尤其在抵御真菌免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可作為病原物防治豌豆蚜的重要靶標(biāo)。另外，由于Dicer-1和Ago-1在昆蟲miRNA通路中的重要作用，我們推測豌豆蚜體內(nèi)依賴Dicer-1和Ago-1的miRNA在其抵御病原物侵染的免疫反應(yīng)中具有重要作用。這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對豌豆蚜免疫防御系統(tǒng)的了解，為豌豆蚜的生物防治提供了理論基礎(chǔ)。