黃 瓊,彭玉玲,馮啟理,牛康康

(華南師范大學生命科學學院,昆蟲科學與技術(shù)研究所,廣東省昆蟲發(fā)育生物學與應用技術(shù)重點實驗室,廣州市昆蟲發(fā)育應用重點實驗室,廣州 510631)

DNA是重要的遺傳物質(zhì)，DNA分子能形成一些非B(non-B)結(jié)構(gòu)(van Holde and Zlatanova,1994)，如Z-DNA、三聯(lián)體(triplex)結(jié)構(gòu)、十字形結(jié)構(gòu)(cruciform)、G-四鏈體(G-quadruplex)和i-motif等結(jié)構(gòu)(Gellertetal.,1962;Frank-Kamenetskii and Mirkin,1995)。在一些鳥嘌呤(guanine,G)富集的區(qū)域會形成一種特殊的四鏈體結(jié)構(gòu)，被稱為G-四鏈體(G4)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被Gellert等(1962)在體外首次發(fā)現(xiàn)。G-四鏈體的結(jié)構(gòu)有很多構(gòu)型(Collie and Parkinson,2011)，現(xiàn)階段研究比較多且結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的是由3個以上G平面構(gòu)成的G4結(jié)構(gòu)(Bugaut and Balasubramanian,2008)，這種結(jié)構(gòu)的G4序列通?？捎媒Y(jié)構(gòu)式表示：…G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3…(N代表A，T或C；數(shù)字表示堿基的數(shù)目)。4個G可以通過Hoogsteen氫鍵連接構(gòu)成一個G-四分體(G-quartet)，1價陽離子(例如K+,Na+等)可以幫助穩(wěn)定G-四分體(Parkinsonetal.,2002)。兩個或多個G-四分體堆疊形成G4結(jié)構(gòu)。由于G束(G-tracts)方向多樣、組成G4的DNA鏈多樣、構(gòu)成G4的G-四分體平面數(shù)不同以及連接各G-四分體的環(huán)(loop)不一樣，導致G4結(jié)構(gòu)構(gòu)型的不一樣，所以G4結(jié)構(gòu)存在構(gòu)型和功能的多樣性(Yakuetal.,2012;Qiuetal.,2015)。

研究結(jié)果顯示，基因組中存在大量潛在的G4序列(Rhodes and Lipps,2015;Bedratetal.,2016)，并且傾向于富集在某些功能域，如啟動子區(qū)、復制起始區(qū)、端粒末端等(Rawaletal.,2006;Reedetal.,2006;Maizels and Gray,2013;Bedratetal.,2016)。G4在基因組中的位置和分布上的保守性暗示了該結(jié)構(gòu)在細胞中起著重要的調(diào)控功能(Nakkenetal.,2009;Capraetal.,2010)。目前G4的生物學功能主要與DNA復制、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、端粒壽命等細胞過程相關(guān)(Bonnaletal.,2003;Bochmanetal.,2012;Valtonetal.,2014;Rhodes and Lipps,2015;Wallgrenetal.,2016;Niuetal.,2019)。幾乎所有這些細胞過程都涉及與G4特異性相互作用的蛋白質(zhì)。G4結(jié)合蛋白的鑒定對于研究DNA G4結(jié)構(gòu)的生物學功能至關(guān)重要。目前已有多個G4結(jié)合蛋白被鑒定出來，它們均與G4結(jié)構(gòu)的形成、解構(gòu)或功能有關(guān)(Arimondoetal.,2000;Mohagheghetal.,2001;Etzionietal.,2005;Londonetal.,2008;Williamsetal.,2017;Niuetal.,2019)。

有研究表明，G4結(jié)構(gòu)在斑馬魚Daniorerio胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，當通過反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)干擾的方法抑制G4形成后，斑馬魚的胚胎發(fā)育受阻，最終死亡(Davidetal.,2016)。本研究為了闡釋G4在家蠶胚胎發(fā)育過程中的功能，我們根據(jù)生物信息學預測的數(shù)據(jù)結(jié)合實時熒光定量PCR的結(jié)果，篩選到家蠶Bombyxmori胚胎發(fā)育因子(embryonic development factor,EDF)基因BmEDF可能受到G4結(jié)構(gòu)的調(diào)控，而且在家蠶胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控功能。通過圓二色譜(circular dichroism,CD)和凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)證明BmEDF的啟動子區(qū)存在G4結(jié)構(gòu)，并且核蛋白BmeIF4H在體外條件下可與BmEDF的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合，二者可能與家蠶的胚胎發(fā)育有一定關(guān)系，研究結(jié)果可為解析家蠶胚胎發(fā)育的DNA高級結(jié)構(gòu)調(diào)控機理提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家蠶材料與主要試劑

實驗材料家蠶為P50(大造)品系，由廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)所提供，在溫度27℃、相對濕度70%±5%和光周期設(shè)定為14L∶10D的恒溫培養(yǎng)箱飼養(yǎng)。家蠶 Bm12卵巢細胞株，用含有10%胎牛血清(HYCLONE,澳洲)的Grace (GIBCO，美國)昆蟲培養(yǎng)基于27～28℃恒溫培養(yǎng)中貼壁培養(yǎng)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScript Reverse Transcription Mix購自Promega公司;熒光定量試劑盒Eastep qPCR Master Mix Kit購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司;核蛋白提取試劑盒Minute Cytoplasmic and Nuclear Extraction Kit購自Invent公司;BCA蛋白定量試劑盒購自貝博公司;鏈霉親和素磁珠購自Thermo公司;化學發(fā)光EMSA試劑盒Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit購自Thermo公司;表達載體為pET28a，為實驗室保存。大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)DH5α以及BL21(DE3)均購自康體生命公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;蛋白純化所用的Ni-NTA鎳柱購自GE Healthcare公司;無血清培養(yǎng)基Opti-MEM購自美國Invitrogen公司;Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑購自Promega公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;pGL3載體以及內(nèi)參載體pRL-SV40購自 Promega公司。

1.2 生物信息學分析

利用軟件QGRS Mapper(https:∥bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php)預測BmEDF的潛在G4序列。將質(zhì)譜鑒定得到的BmEDF蛋白質(zhì)序列與UniProt、家蠶數(shù)據(jù)庫silkDB3.0(https:∥silkdb.bioinfotoolkits.net/main/species-info/-1)和NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)等蛋白數(shù)據(jù)庫的序列進行比對。BmEDF基因編號BGIBMGA003873為家蠶數(shù)據(jù)庫silkDB3.0登錄號。用軟件SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)對其結(jié)構(gòu)域進行預測，利用軟件Genscript和NLS Mapper進行核定位信號預測，利用軟件Compute pI/Mw Tool(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)進行等電點預測。

1.3 G4結(jié)構(gòu)的圓二色譜檢驗

圓二色譜(CD)是研究DNA高級結(jié)構(gòu)常用的方法之一，根據(jù)DNA樣品吸收峰所在的位置，可以判斷該DNA樣品是否含有DNA高級結(jié)構(gòu)(Cogoi and Xodo,2006)。將BmEDF的G4序列送至賽默飛公司合成探針，并在探針5′端用生物素(BIO)標記，得到的帶標簽的G4寡核苷酸探針按比例稀釋至100 mmol/L的工作液濃度，配制退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,5 μmol/L探針,100 mmol/L KCl)，以不加KCl(0 mmol/L)的退火體系作為對照。混合均勻后于95℃加熱10 min，置于沸水中緩慢(4 h以上)冷卻至室溫，促進G4序列形成G4結(jié)構(gòu)。

利用CD法檢查G4序列和G4結(jié)構(gòu)。CD實驗采用J-815型CD光譜儀(Jasco International,美國)進行。采集的光譜波長范圍為220～350 nm，步長為1 nm，響應時間為1 s。CD光譜以在室溫下對同一樣品的3次掃描平均值的表示，并根據(jù)緩沖區(qū)對信號的貢獻進行基線校正。本實驗所用的BmEDF(BGIBMGA003873)啟動子區(qū)的G4序列為：野生型(WT):5′-TGGTGGGTGGTGGGGAGCGCGGGAGGG GTGCG-3′;突變型(Mut):5′-TGGTGAGTGATGAA GAGCGCGAGAGAGATGCG-3′(下同)。

1.4 G4結(jié)構(gòu)的電泳遷移實驗

電泳遷移實驗同樣可以用于檢驗DNA高級結(jié)構(gòu)是否形成。使用Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit(Thermo,上海)進行EMSA實驗，配制帶生物素標記的野生型和突變型G4寡核苷酸探針退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,100 mmol/L KCl,5 mmol/L DNA探針)，以及野生型G4寡核苷酸探針不加KCl作為對照組退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,5 mmol/L DNA探針)，混合均勻后于95℃加熱10 min，置于沸水中緩慢(4 h以上)冷卻至室溫，促進G4序列形成G4結(jié)構(gòu)，取上述退火探針2 μL稀釋50倍。參照EMSA試劑盒說明書配制20 μL反應體系，用4%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分析樣品，冰上90 V進行電泳，溴酚藍遷移至凝膠2/3處停止電泳，凝膠被印跡在帶正電的尼龍膜上(Amersham Biosciences,Boston,美國)，使用化學發(fā)光EMSA試劑盒進行顯影。

1.5 BmEDF啟動子活性實驗

將BmEDF啟動子區(qū)片段連接到pGL3質(zhì)粒中，同時連接突變G4序列的啟動子區(qū)片段到pGL3質(zhì)粒中作為對照。在24孔細胞培養(yǎng)板里植入105/mL的細胞，培養(yǎng)過夜，至細胞密度80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。取0.5 μg目的載體以及0.05 μg內(nèi)參載體pRL-SV40，1.5 μL轉(zhuǎn)染試劑，加入25 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中充分混勻，室溫靜置15～20 min，然后轉(zhuǎn)染Bm12細胞。熒光素酶活性測定參照上海翊圣生物科技有限公司的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行。上述Bm12細胞轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加200 μL裂解液，于4℃搖床輕微震蕩5 min，充分裂解細胞，于10 000 r/min離心1 min，取20 μL裂解液100 μL熒光素酶底物混勻，用 Promega Glo Max 發(fā)光檢測儀測定熒光素酶活性A后，加入100 μL反應終止液，繼續(xù)測定海參熒光素酶發(fā)光值B，A/B的比值即為相對熒光素酶活性(relative luciferase activity,RLA)，同一轉(zhuǎn)染實驗重復3次。

1.6 BmEDF,BmeIF4H和BmADDH表達的qRT-PCR檢測

根據(jù)BmEDF(BGIBMGA003873)，BmeIF4H(GenBank登錄號:NM_001044195.1)以及BmADDH(GenBank登錄號:XM_038013091.)序列利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物序列，BmEDF-F:5′-GTTTCGTGATCGACACCGCC-3′;BmEDF-R:5′-GA CGGGTGAAAGGCTGGGTT-3′;BmeIF4H-F:5′-CCC ACCAGACCAGACACTTC-3′;BmeIF4H-R:5′-CCG CCGAATATCGACGAAGA-3′；BmADDH-F:5′- TGGT GGCACTCTGTTAGTCC-3′;BmADDH-R:5′- TGTA CTATTTCAACATTACGCCAC-3′。內(nèi)參基因為BmRP49，引物序列為:BmRP49-F:5′-CAGGCGGTTCAAGGG TCAATAC-3′;BmRP49-R:5′-TGCTGGGCTCTTTCC ACGA-3′。引物由擎科生物公司合成。取家蠶胚胎發(fā)育各時期(即產(chǎn)后0.5,2,3,8,16,24,32,40,48,72,96,120,144,156,168,180,196和216 h)的卵，每個時期取約30粒卵為1組，取3組重復，提取RNA，參照GoScript Reverse Transcription Mix試劑盒說明書進行加樣，并按照說明書程序反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。參照Eastep qPCR Master Mix Kit試劑盒說明書進行加樣，混合均勻后按兩步法PCR擴增程序進行qRT-PCR檢測，3次技術(shù)重復，擴增程序:95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,40個循環(huán)。

1.7 家蠶胚胎核蛋白的提取及濃度測定

取家蠶產(chǎn)卵后第1-9天的卵若干，每天30粒左右，將不同時期的所有卵混合，以PBS緩沖液沖洗兩次，參照Minute Cytoplasmic and Nuclear Extraction Kit(Invent,北京)試劑盒說明書進行核蛋白提取。核蛋白濃度用BCA蛋白定量試劑盒進行測定。蛋白樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的家蠶胚胎核蛋白電泳遷移實驗

使用Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit(Thermo,上海)進行EMSA實驗，配制帶生物素標記的野生型和突變型G4寡核苷酸探針退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,100 mmol/L KCl,5 mmol/L DNA探針)，混合均勻后于95℃加熱10 min，置于沸水中緩慢(4 h以上)冷卻至室溫，促進G4序列形成G4結(jié)構(gòu)，取上述退火探針2 μL稀釋50倍。參照EMSA試劑盒說明書配制20 μL反應體系，實驗組中加入1.7節(jié)提取的家蠶胚胎核蛋白10 μg，于室溫下靜置反應20 min，對于競爭反應，競爭探針(相同的DNA序列但沒有生物素標記)按比例添加到結(jié)合反應中。反應結(jié)束后，用4%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分析樣品，冰上90 V進行電泳，溴酚藍遷移至凝膠2/3處停止電泳，凝膠被印跡在帶正電的尼龍膜上(Amersham Biosciences,Boston,美國)，使用化學發(fā)光EMSA試劑盒進行顯影。

按上述實驗步驟，配制兩塊同樣4%的聚丙烯酰胺凝膠，制備兩份實驗所用反應樣品，使用的所有試劑所有操作以及孵育溫度時間等條件都相同，分別上樣至兩塊膠中，在同樣條件下進行凝膠遷移，遷移結(jié)束后將其中一塊進行后續(xù)印跡顯影操作，另一塊置于0.5×TBE緩沖液中，4℃保存。顯影成功后將尼龍膜與凝膠對應，將有滯后條帶對應位置的凝膠切下，送至輝駿生物公司(廣州)進行蛋白質(zhì)譜鑒定。由于與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白，應該是存在于細胞核中，所以我們根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果優(yōu)先挑選蛋白分子量在20～40 kD之間的轉(zhuǎn)錄因子，含有核定位信號的蛋白，并具有蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域的蛋白，或者有研究顯示其功能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等有一定關(guān)系的蛋白作為與BmEDFG4結(jié)構(gòu)結(jié)合的候選蛋白。

1.9 與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的候選蛋白BmeIF4H和BmADDH的基因克隆、重組表達與純化

為了驗證BmeIF4H蛋白與BmADDH蛋白是否可以與BmEDF G4結(jié)構(gòu)結(jié)合，取家蠶胚胎發(fā)育各時期(即1-9 d)的卵提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)BmeIF4H(GenBank登錄號:NM_001044195.1)和BmADDH(GenBank登錄號:XM_038013091.1)基因的CDS序列設(shè)計和合成引物，BmEIF4H的擴增引物：EIF4H-F:5′-GGATCCGATTTGCAGTGTTCCA TGTTTCT-3′；EIF4H-R:5′-AAGCTTACTCATTCGTT TCCCTTAAGTTCT-3′。BmADDH的擴增引物:ADDH-F:5′-GGATCCATGGCACACAAACATTCGCT TG-3′；ADDH-R:5′-AAGCTTTCACTCGAGATTTATG TAATTCG-3′。以家蠶卵cDNA為模板，PCR擴增得到候選蛋白BmeIF4H和BmADDH基因的開放閱讀框。PCR擴增體系(20 μL):cDNA 2 μL,Taq酶0.2 μL,dNTPs 1 μL,10×PCR Buffer 1 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O 15 μL。擴增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,34個循環(huán)；72℃ 10 min。16℃永久保存。將獲得的DNA片段克隆到帶His標簽的pET-28a(+)表達載體中，構(gòu)建pET-28a-BmeIF4H和pET-28a-BmADDH重組表達載體。

將pET-28a-BmeIF4H及表達質(zhì)粒(對照)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，在含有100 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L IPTG，于37℃ 220 r/min誘導4 h。離心收集菌體，結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl)重懸菌體，混合后放置冰上超聲破碎，4℃離心取上清，根據(jù)說明書使用Ni-NTA鎳柱進行純化，結(jié)合緩沖液配制含咪唑的濃度梯度洗脫液洗脫非特異性結(jié)合蛋白，咪唑濃度梯度分別為20 mmol/L(30 mL),50 mmol/L(20 mL),100 mmol/L(20 mL)和400 mmol/L(6 mL)和1 000 mmol/L(6 mL)。純化蛋白在4℃條件下用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl)透析過夜去除咪唑。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。純化蛋白用SDS-PAGE檢測。對于BmADDH蛋白的表達和純化條件與BmeIF4H的相同，但結(jié)合緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl,6 mol/L尿素。純化蛋白在4℃條件下用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl,尿素) 透析過夜，尿素濃度從6 mol/L到4 mol/L到2 mol/L逐漸遞減，以使蛋白復性。

1.10 候選蛋白BmeIF4H和BmADDH與G4結(jié)構(gòu)和G4序列結(jié)合的電泳遷移實驗驗證

候選蛋白BmeIF4H和BmADDH的獲取見1.9節(jié)，BmeIF4H和BmADDH與G4結(jié)構(gòu)和G4序列結(jié)合的電泳遷移實驗的實驗步驟同1.8節(jié)。本實驗所用的BmEDF(BGIBMGA003873)啟動子區(qū)的G4序列為：野生型(WT):5′-TGGTGGGTGGTGGGGA GCGCGGGAGGGGTGCG-3′;突變型(Mut):5′-TG GTGAGTGATGAAGAGCGCGAGAGAGATGCG-3′。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準誤表示，兩組數(shù)據(jù)之間的差異顯著性用Student氏t檢驗進行分析，多組數(shù)據(jù)間的差異顯著性采用單因素方差分析及post-hocTurkey氏HSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BmEDF啟動子區(qū)的G4序列可形成G4結(jié)構(gòu)

對基因BmEDF的啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)在該基因啟動子-47--70 bp位置區(qū)間內(nèi)CG含量高達75%，經(jīng)QGRS Mapper軟件分析在-47--70 bp位置預測到一個G4序列。CD結(jié)果顯示，該野生型G4序列在沒有KCl存在的情況下(圖1:A，黑色曲線)最大和最小吸收峰分別在263和240 nm，但波峰波谷不明顯。在100 mmol/L KCl存在情況下，野生型最大吸收峰和最小吸收峰分別在265和240 nm處明顯增強，波峰波谷明顯(圖1:A，紅色曲線)，這是典型的平行G4結(jié)構(gòu)的CD譜(Carvalhoetal.,2017;del Villar-Guerraetal.,2018)，K+有利于G4結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定。當G4序列突變后(圖1:A，藍色曲線)CD峰圖發(fā)生了改變，263和240 nm處吸收峰消失，說明突變后序列無法形成G4結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果說明，BmEDF的G4序列在體外可以形成平行的G4結(jié)構(gòu)。

EMSA結(jié)果顯示，在未加KCl時，野生型G4高級結(jié)構(gòu)形成很少，主要存在一條單鏈自由探針(圖1:B，泳道1)，在加入KCl時，有助于G4高級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定，在單鏈自由探針后方有一明顯條帶(圖1:B,泳道2)，說明其已形成G4結(jié)構(gòu)。當序列突變后，單鏈探針后方的條帶消失不見，(圖1:B,泳道3)，說明突變后序列無法形成G4結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果同樣說明，BmEDF基因的G4序列在體外可以形成平行的G4結(jié)構(gòu)。

通過突變G4序列，檢測G4對BmEDF基因啟動子活性的影響，結(jié)果(圖1:C)顯示，對比野生型G4序列，突變G4序列后，其啟動子活性顯著下降了大約3/4(P<0.01)，說明BmEDFG4結(jié)構(gòu)的存在對BmEDF轉(zhuǎn)錄表達具有正調(diào)控的作用。

圖1 家蠶BmEDF G4結(jié)構(gòu)的圓二色譜(A)和凝膠遷移實驗(B)驗證及其對BmEDF啟動子活性的影響(C)Fig.1 Validation of the G4 structure of BmEDF of Bombyx mori by circular dichroism (A) and EMSA (B) and its effects on the promoter activity of BmEDF (C)EMSA:凝膠遷移實驗Electrophoretic mobility shift assay;WT:野生型Wild-type;Mut:突變型Mutant.圖3,5和6同。The same for Figs.3,5 and 6.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上雙星號表示兩組間差異極顯著(P<0.01,Student氏t檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Double asterisk above bars indicates extremely significant difference between two groups (P<0.01,Student’s t-test).

2.2 家蠶胚胎發(fā)育時期BmEDF基因的表達

qRT-PCR結(jié)果(圖2)顯示，BmEDF基因在家蠶胚胎發(fā)育時期的表達量一直較低，但在產(chǎn)卵后120 h時表達量顯著升高(P<0.05)。

圖2 BmEDF在不同發(fā)育階段家蠶胚胎中的表達量Fig.2 Expression levels of BmEDF in Bombyx mori embryos at different developmental stages圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05,單因素方差分析,post-hoc Turkey氏HSD檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Different small letters above bars represent significant difference (P<0.05,one-way ANOVA,post-hoc Turkey’s HSD test).

2.3 篩選的與BmEDF基因G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白

EMSA實驗結(jié)果如圖3所示，野生型G4序列探針與家蠶胚胎核蛋白孵育明顯出現(xiàn)3條遷移滯后的條帶，并且加入競爭探針之后，3條結(jié)合條帶逐漸消失，隨著競爭探針濃度增加3條條帶在逐漸減弱，100倍競爭探針競爭時，條帶幾乎消失不見。這一結(jié)果說明，這3個條帶可能是BmEDF基因的G4與家蠶胚胎核蛋白專一結(jié)合的蛋白條帶。

圖3 EMSA篩選與BmEDF G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的家蠶胚胎核蛋白Fig.3 EMSA experiments of screening embryonic nuclear protein in Bombyx mori binding with the G4 structure of BmEDF泳道Lanes 1-6:1:不加KCl的野生型探針WT probe not added with KCl;2:加入100 mmol/L KCl的野生型探針WT probe added with 100 mmol/L KCl;3:加入100 mmol/L KCl野生型探針+胚胎核蛋白WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein;4:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+胚胎核蛋白+10×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein+10×cold probe;5:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+胚胎核蛋白+50×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein+50×cold probe;6:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+胚胎核蛋白+100×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCI+embryonic nuclear protein+100×cold probe.

2.4 與BmEDF基因G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白質(zhì)譜鑒定

從圖3中的3條蛋白帶中共鑒定到29種蛋白，篩選得到的其中的兩個候選蛋白BmADDH (GenBank登錄號:XM_038013091.1)和BmeIF4H (GenBank登錄號:NM_001044195.1)均是細胞核蛋白，具有與DNA和蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。BmADDH和BmeIF4H在家蠶胚胎發(fā)育過程中的表達情況結(jié)果顯示，BmADDH和BmeIF4H在BmEDF高表達時期(產(chǎn)卵后120 h時)(圖2)之前都有一個較高的表達峰(圖4)。這個結(jié)果進一步表明BmADDH和BmeIF4H可能是BmEDF基因上游的調(diào)控因子。

圖4 qRT-PCR檢測BmeIF4H (A)和BmADDH (B)在家蠶胚胎發(fā)育各時期的表達量Fig.4 Expression levels of BmeIF4H (A) and BmADDH (B) in Bombyx mori embryo at different developmental stages detected by qRT-PCR

2.5 BmeIF4H和BmADDH蛋白與BmEDF G4結(jié)構(gòu)的結(jié)合

原核表達獲得BmeIF4H和BmADDH重組蛋白(圖5:A,B;圖6:A,B)。EMSA結(jié)果顯示，形成G4高級結(jié)構(gòu)的探針在凝膠中比單鏈DNA探針遷移得慢，在自由單鏈探針后方有一明顯條帶，說明其已形成G4結(jié)構(gòu)(圖5:C，泳道1)。在加入BmeIF4H蛋白后，G4結(jié)構(gòu)的條帶明顯減弱，同時在上方出現(xiàn)一條明顯的結(jié)合條帶(圖5:C，泳道2)，并且隨著蛋白量下降，該條帶的結(jié)合下降(圖5:C，泳道2-4)。在加入競爭探針后，結(jié)合條帶明顯減弱，G4結(jié)構(gòu)的條帶則明顯增強，并且隨著競爭探針濃度的增加，結(jié)合的條帶逐漸減弱直至消失，G4結(jié)構(gòu)的條帶增強至原始強度(圖5:C，泳道5-8)。而突變探針在G4結(jié)構(gòu)位置無明顯條帶，說明突變后不能形成G4高級結(jié)構(gòu)，結(jié)合條帶也沒有出現(xiàn)(圖5:C，泳道9)，即BmeIF4H蛋白不與突變序列結(jié)合，說明BmeIF4H蛋白與BmEDFG4結(jié)構(gòu)結(jié)合，但并不與G4序列結(jié)合。加入BmADDH蛋白后，無明顯的蛋白-G4結(jié)合條帶，且G4結(jié)構(gòu)條帶并沒有明顯變化，隨著蛋白量的增加，也無結(jié)合條帶出現(xiàn)，說明BmADDH蛋白可能并不與BmEDFG4結(jié)構(gòu)直接結(jié)合(圖6:C)。

圖5 BmeIF4H蛋白表達(A)和純化(B)及其與BmEDF G4結(jié)合的EMSA分析(C)Fig.5 Expression (A) and purification (B) of BmeIF-4H and EMSA analysis of its binding with the G4 structure of BmEDF (C)M:蛋白標準分子量Protein molecular mass standard;1:未經(jīng)IPTG誘導Not induced by IPTG;2:總蛋白Total protein;3:上清蛋白 Supernatant protein;4:沉淀蛋白Precipitated protein;5:上清蛋白過柱Supernatant protein through the column;6:結(jié)合緩沖液過柱Binding buffer through the column;7-13:分別用20,50,100,400,400,400和1 000 mmol/L咪唑洗脫Elution with 20,50,100,400,400,400 and 1 000 mmol/L imidazole,respectively;14:加入100 mmol/L KCl的野生型探針WT probe added with 100 mmol/L KCl;15:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+138 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+138 μmol/L BmeIF4H;16:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H;17:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+34.5 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+34.5 μmol/L BmeIF4H;18:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H +10×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H+10×cold probe;19:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H+50×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +50×cold probe;20:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H +100×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +100×cold probe;21:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H +200×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +200×cold probe;22:加入100 mmol/L KCl的突變型探針+69 μmol/L BmeIF4H Mut probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H.

圖6 BmADDH蛋白表達(A)和純化(B)及其與BmEDF G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的EMSA分析(C)Fig.6 Expression (A) and purification (B) of BmADDH and EMSA analysis of its binding with the G4 structure of BmEDFM:蛋白標準分子量Protein molecular mass standard;1:未經(jīng)IPTG誘導Not induced by IPTG;2,5:總蛋白Total protein;3,6:上清蛋白Supernatant protein;4,7:沉淀蛋白Precipitated protein;8:蛋白過柱Protein through the column;9:結(jié)合緩沖液過柱Binding buffer through the column;10-13:分別為用20，50,100和400 mmol/L咪唑洗脫Elution with 20,50,100 and 400 mmol/L imidazole,respectively;14,15:依次用2和0 mol/L尿素進行透析Diaysis with 2 and 0 mol/L urea subsequently;16:用PBS緩沖液進行透析Dialysis with PBS buffer;17:加入100 mmol/L KCl的野生型探針WT probe added with 100 mmol/L KCl;18:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+260 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+260 μmol/L BmADDH;19:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+130 μmol/L BmADDH;20:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+65 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+65 μmol/L BmADDH;21:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH +10×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +10×cold probe;22:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH +50×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +50×cold probe;23:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH +100×競爭探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +100×cold probe;24:加入100 mmol/L KCl的突變型探針+130 μmol/L BmADDH Mut probe added with 100 mmol/L KCl+130 μmol/L BmADDH.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)BmEDF基因啟動子區(qū)含有潛在的G4序列，在體外可以形成G4結(jié)構(gòu)(圖1)。我們前期在家蠶中鑒定到一個特異性G4結(jié)合蛋白BmLARK (Niuetal.,2019)，那么BmLARK蛋白是否通過與BmEDF基因的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合而發(fā)揮作用的呢？然而在核蛋白的質(zhì)譜分析中并沒有鑒定到BmLARK，可能原因是多樣的：第一，BmEDF的G4可能并不與BmLARK結(jié)合；第二，BmLARK蛋白與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合作用較弱，沒有檢測到它們的結(jié)合；第三，與G4結(jié)構(gòu)相結(jié)合并且發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白可能并不是單一的，而是多個蛋白共同與其結(jié)合，形成蛋白復合體進而發(fā)揮其調(diào)控作用；第四，在體內(nèi)發(fā)生結(jié)合作用的蛋白，在體外實驗過程中，可能因為沒有合適的條件因而不結(jié)合了。因此本研究通過DNA pull-down和EMSA等方法鑒定與BmEDF啟動子G4特異性結(jié)合的蛋白，結(jié)果顯示體外條件下BmeIF4H與BmEDF基因啟動子區(qū)的G4結(jié)構(gòu)可以結(jié)合(圖5)。BmeIF4H是翻譯起始因子，在蛋白質(zhì)翻譯過程中發(fā)揮作用。該蛋白含有RNA識別結(jié)構(gòu)域(RNA recognization motif,RRM)，RRM可以與RNA序列結(jié)合，也可以與DNA序列結(jié)合(Marisetal.,2005)。在BmLARK中，含有兩個RRM，它們是與BmPOUM2的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合所必需的(Pengetal.,2021)。有研究表明，兔eIF4H在蛋白質(zhì)翻譯合成中能夠刺激其他真核啟動因子例如eIF4B和eIF4F的體外活性(Richteretal.,1998)。雖然，我們還沒有研究證據(jù)表明BmeIF4H參與了家蠶的胚胎發(fā)育過程，但是由于BmEDF基因在家蠶胚胎中后期上調(diào)表達，而BmeIF4H能與BmEDF基因的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合，因此我們推測BmeIF4H和BmEDF可能參與了家蠶的胚胎發(fā)育過程。

本研究鑒定到一個可能與BmEDF基因G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白BmeIF4H，兩者之間的結(jié)合及調(diào)控活性還需進一步驗證。但這一結(jié)果為深入研究G4結(jié)構(gòu)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和家蠶胚胎發(fā)育提供了依據(jù)，為G4-蛋白相互作用的生物功能研究提供參考。