王晶晶 黃樺 晏林 高杉 李騫 王丹 張峻

中圖分類號 R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）02-0217-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.15

摘 要 目的 建立測定人胎盤灌流液中氟西汀、去甲氟西汀、舍曲林濃度的方法并測定胎盤透過率。方法 以格列本脲為內(nèi)標(biāo)，采用蛋白沉淀法對樣品進(jìn)行前處理，采用超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UFLC-MS/MS）法檢測。以SynergiTM Hydro-RP 80A LC為色譜柱，以水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.70 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 309.9→148.1（氟西?。?、m/z 296.0→134.4（去甲氟西汀）、m/z 306.1→159.0（舍曲林）、m/z 493.9→369.1（內(nèi)標(biāo)）。建立單個(gè)胎盤小葉雙向循環(huán)灌注模型，在母體側(cè)胎盤灌流液中加入氟西?。?60 ng/mL）、去甲氟西?。?60 ng/mL）、舍曲林（100 ng/mL）和安替比林（陽性對照，100 ng/mL），采用上述UFLC-MS/MS法于循環(huán)0、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min時(shí)分別測定氟西汀、去甲氟西汀、舍曲林的濃度并計(jì)算胎盤透過率。結(jié)果 氟西汀、去甲氟西汀、舍曲林檢測質(zhì)量濃度的線性范圍均為5.00～500 ng/mL（r均大于0.990），定量下限均為5.00 ng/mL;日內(nèi)、日間RSD均不高于14.0%，相對誤差為-9.6%～14.7%;穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對誤差為-4.0%～11.0%;殘留效應(yīng)、提取方法、基質(zhì)效應(yīng)均不影響待測成分的定量分析。成功建立人胎盤體外循環(huán)灌注模型31個(gè)，其中15個(gè)為氟西汀、去甲氟西汀灌流，10個(gè)為舍曲林灌流，6個(gè)為安替比林灌流。灌流3 h后，氟西汀、去甲氟西汀、舍曲林的平均胎盤透過率分別為（8.74±1.67）%、（10.70±4.81）%、（5.90%±1.25）%。結(jié)論 所建UFLC-MS/MS法操作簡便、靈敏度和準(zhǔn)確度均較高，可用于測定人胎盤灌流液中氟西汀、去甲氟西汀及舍曲林的濃度。氟西汀、去甲氟西汀、舍曲林均可透過胎盤，但舍曲林的胎盤透過率更低。

關(guān)鍵詞 氟西汀;去甲氟西汀;舍曲林;超快速液相-串聯(lián)質(zhì)譜法;胎盤灌流;胎盤透過率

Determination of fluoxetine， norfluoxetine and sertraline concentration in human placental perfusate and their placental permeability by UFLC-MS/MS

WANG Jingjing1，HUANG Hua1，YAN Lin1，GAO Shan1，LI Qian1，WANG Dan2，ZHANG Jun1（1. Dept. of Clinical Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650032， China; ? ? 2. Dept. of Neurology， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650032， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To establish the method for determining the concentrations of fluoxetine， norfluoxetine and sertraline in human placental perfusate method and their placental permeability. METHODS Using glyburide as internal standard， the samples were pretreated by protein precipitation method and detected by ultra-fast liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer （UFLC-MS/MS）. The determination was performed on SynergiTM Hydro-RP 80A LC column with mobile phase consisted of water （containing 0.1% formic acid）-acetonitrile （containing 0.1% formic acid） at the flow rate of 0.70 mL/min， with a gradient elution. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 5 μL. Detection was performed with electrospray ionization source in multiple reaction monitoring mode. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 309.9→148.1 （fluoxetine）， m/z 296.0→134.4 （norfluoxetine）， m/z 306.1→159.0 （sertraline）， m/z 493.9→369.1 （internal standard）. The perfusion model of singal placenta under bidrectional cardiopulmonary bypass was established. Fluoxetine （160 ng/mL）， norfluoxetine （160 ng/mL）， sertraline （100 ng/mL） and antipyrine （positive control， 100 ng/mL） were added into the maternal perfusate. The concen- trations of fluoxetine， norfluoxetine and sertraline were measured by above UFLC-MS/MS at 0， 10， 20， 30， 45， 60， 90， 120， 150 and 180 min of circulation， and the placental permeability was calculated. RESULTS The linear range of fluoxetine， norfluoxetine and sertraline were 5.00-500 ng/mL （all r>0.990）， and the lower limits of quantification were all 5.00 ng/mL. The RSDs of intra-day and inter-day were all less than 14.0%， and relative error ranged -9.6% to 14.7%. The relative error of stability test was -4.0% to 11.0%; the residual effect， extraction method and matrix effect did not affect the quantitative analysis of the substance to be tested. Totally 31 perfusion model of human placenta under cardiopulmonary bypass were successfully established， including 15 fluoxetine and norfluoxetine perfusion， 10 sertraline perfusion and 6 antipyrine perfusion. After 3 hours of perfusion， the average placental permeability of fluoxetine， norfluoxetine and sertraline were （8.74±1.67）%， （10.70±4.81）%， （5.90±1.25）%， respectively. CONCLUSIONS The established UPLC-MS/MS is simple， sensitive and accurate. It can be used for determination of fluoxetine， norfluoxetine and sertraline in human placental perfusate. Fluoxetine， norfluoxetine and sertraline can pass through the placenta， but sertraline has a lower placental permeability.

KEYWORDS ? fluoxetine; norfluoxetine; sertraline; ultra-fast liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer; placental perfusate; placental permeability

妊娠期婦女因生理、心理等多方面的變化，可能出現(xiàn)妊娠期焦慮和抑郁[1-2]。有研究表明，妊娠期抑郁癥可對妊娠期婦女和胎兒的健康造成諸多不利影響，如致胎兒心血管畸形、肺動(dòng)脈高壓、早產(chǎn)等[3]。中、重度以上的妊娠期抑郁癥婦女需要接受藥物治療[4-5]。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）是一種新型的抗抑郁藥物，包括氟西?。╢luo- xetine，F(xiàn)XT）、舍曲林（sertraline，SERT）、西酞普蘭、帕羅西汀、氟伏沙明等[6]，其中FXT和SERT均是《中國抑郁障礙防治指南（第二版）》推薦的一線抗抑郁藥物，也是妊娠期抑郁癥婦女使用最多的SSRI類抗抑郁藥物[7-10]。有研究指出，F(xiàn)XT在體內(nèi)可代謝為具有抗抑郁活性的去甲氟西?。╪orfluoxetine，NFXT）[9]。目前，關(guān)于SSRI用于妊娠期抑郁癥的安全性尚未明確，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠期婦女娩出的胎兒相比，妊娠期使用FXT婦女娩出胎兒的不良結(jié)局更明顯，主要表現(xiàn)為心臟畸形（包括房室隔缺損、房室瓣缺損或房室瓣關(guān)閉不全等），發(fā)生率為1.18%～1.60%，高于正常妊娠期婦女娩出胎兒心臟畸形的發(fā)生率（0.40%～1.00%）[11-12]。因此，檢測FXT、NFXT、SERT的濃度就顯得尤為重要。

在妊娠期用藥安全性評價(jià)中，胎兒的藥物暴露量常被作為風(fēng)險(xiǎn)評估的理論基礎(chǔ)和重要參考，而胎盤屏障是胎兒與母體之間最重要的物質(zhì)交換通道[13]。因此，研究藥物的胎盤透過率，明確藥物透過胎盤的速度和程度，可作為妊娠期用藥安全性評價(jià)研究的方法之一，也是妊娠期用藥安全性評價(jià)內(nèi)容的重要依據(jù)和補(bǔ)充。目前，我國尚無FXT、NFXT、SERT胎盤透過性研究的相關(guān)報(bào)道。本課題組前期已成功建立了人胎盤灌注模型，并對藥物的胎盤透過性進(jìn)行了研究[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-fast liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，UFLC- MS/MS）法建立了測定人胎盤灌流液中FXT、NFXT、SERT濃度的方法，探討了上述成分的胎盤透過率，旨在為妊娠期安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有API 3200TM型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀及配備的電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）、氮?dú)庠?、Analyst Software 1.5.2定量處理軟件（美國AB SCIEX公司），LC-20AD型液相色譜系統(tǒng)及配備的LC-20AD XR型高壓泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC型柱溫箱、DGU-20A3型在線脫氣機(jī)（日本Shimadzu公司），XPE105型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），SB3222型超聲儀[必能信超聲（上海）有限公司]，Elix型純水儀（美國Merck Millipore公司），XH-B型渦旋混勻器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司），5804R型低溫高速臺式離心機(jī)、移液器（德國Eppendorf公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鹽酸氟西汀對照品（批號100513-201602，純度99.3%）、鹽酸舍曲林對照品（批號100702-202103，純度99.8%）、格列本脲對照品（內(nèi)標(biāo)，批號100135-201806，純度99.8%）、安替比林對照品（陽性對照，批號100506-202003，純度>99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院;鹽酸去甲氟西汀對照品（批號10716，純度99.0%）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;低分子右旋糖酐（批號P1054729）購自上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司;氯化鈉注射液（國藥準(zhǔn)字H19994067，批號S1709062，規(guī)格100 mL ∶ 0.9 g）購自上海百特醫(yī)療用品有限公司;Krebs-Ringer緩沖液（含葡萄糖1.8 g/L、氯化鎂0.047 g/L、氯化鉀0.34 g/L、氯化鈉7.0 g/L、磷酸氫二鈉0.1 g/L、磷酸二氫鈉0.18 g/L，批號11801060）購自北京索萊寶科技有限公司;碳酸氫鈉注射液（國藥準(zhǔn)字H41021050，批號11807201，規(guī)格10 mL ∶ 0.5 g）購自遂成藥業(yè)股份有限公司;注射用青霉素鈉（國藥準(zhǔn)字H13020657，批號F7032124，規(guī)格80萬單位）購自華北制藥股份有限公司;肝素鈉注射液（國藥準(zhǔn)字H32020612，批號51809105，規(guī)格2 mL ∶ 12 500單位）購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;小牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）干粉（批號0306C272）購自美國VWR Life Science公司;甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品貯備液 精密稱取鹽酸氟西汀對照品2.79 mg、鹽酸去甲氟西汀對照品2.80 mg、鹽酸舍曲林對照品2.79 mg，用甲醇溶解并定容，制得FXT、NFXT、SERT質(zhì)量濃度均為50.0 μg/mL的混合對照品貯備液，于-30 ℃下保存，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液、質(zhì)控工作溶液和內(nèi)標(biāo)工作溶液 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋，制成FXT、NFXT、SERT質(zhì)量濃度均分別為5 000、2 500、1 250、500、250、125、50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。另取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品貯備液，用甲醇稀釋，制得FXT、NFXT、SERT質(zhì)量濃度均分別為4 500、2 500、150 ng/mL的系列質(zhì)控工作溶液。精密稱取內(nèi)標(biāo)對照品150 mg，用乙腈溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，于-30 ℃下保存;使用時(shí)，取上述內(nèi)標(biāo)貯備液80.0 μL，加入乙腈300 mL稀釋，混勻，制得質(zhì)量濃度為800 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.1.3 空白胎盤灌流液和含藥胎盤灌流液 取Krebs- Ringe緩沖液500 mL，加入5%碳酸氫鈉注射液4 mL、肝素鈉注射液2 mL、注射用青霉素鈉0.48 g，混勻后，加入BSA 15.0 g，充分?jǐn)嚢?，溶解。將該溶液均分?份，其中1份加入低分子右旋糖酐7.5 g，充分?jǐn)嚢杈鶆?，得子體側(cè)胎盤灌流液（含低分子右旋糖酐約30 g/L，即空白胎盤灌流液）。另1份加入低分子右旋糖酐2.1 g，充分?jǐn)嚢杈鶆?，得母體側(cè)胎盤灌流液（含低分子右旋糖酐約8.4 g/L）。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液 取“2.1.3”項(xiàng)下空白胎盤灌流液180 μL，加入“2.1.2”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液20 μL，制得FXT、NFXT、SERT質(zhì)量濃度均分別為500、250、125、50.0、25.0、12.5、5.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液。

2.1.5 質(zhì)控樣品溶液 取“2.1.3”項(xiàng)下空白胎盤灌流液180 μL，加入“2.1.2”項(xiàng)下系列質(zhì)控工作溶液20 μL，制得FXT、NFXT、SERT質(zhì)量濃度均分別為450、250、15.0 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液。

2.2 樣品處理

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液及質(zhì)控樣品溶液 取“2.1.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液及“2.1.5”項(xiàng)下質(zhì)控樣品溶液各200 μL，加入“2.1.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)工作溶液800 μL，渦旋混勻，以14 000 r/min離心8 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.2.2 胎盤灌流液樣品 取“2.1.3”項(xiàng)下胎盤灌流液樣品180 μL，加入甲醇20 μL，混勻，加入“2.1.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)工作溶液800 μL，渦旋混勻，以14 000 r/min離心8 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 以SynergiTM Hydro-RP 80A LC（50 mm×2 mm，4 μm）為色譜柱，以水（含0.1%甲酸，A）-乙腈（含0.1%甲酸，B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～1.00 min，2%B;1.00～2.00 min，2%B→90%B;2.00～3.00 min，90%B;3.00～3.10 min，90%B→2%B;3.10～4.00 min，2%B）;流速為0.70 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI，檢測模式為正離子模式，以多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行掃描;離子源電壓為5 000 V;離子化溫度為600 ℃;霧化氣（gas1，N2）壓力為414 kPa;輔助氣（gas2，N2）壓力為345 kPa;碰撞氣壓力為83 kPa;氣簾氣壓力為83 kPa;采用Analyst Software 1.5.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。FXT、NFXT、SERT及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1，其質(zhì)譜圖見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別取“2.1”項(xiàng)下空白胎盤灌流液、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液、含藥胎盤灌流液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理（空白胎盤灌流液勿需添加內(nèi)標(biāo)）后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，胎盤灌流液中的緩沖液、低分子右旋糖酐等物質(zhì)對各藥物的測定無干擾，表明該方法專屬性良好。結(jié)果見圖2。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測成分的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸（權(quán)重為1/x）。結(jié)果顯示，F(xiàn)XT的回歸方程為y=0.003 88x+0.001 15（r=0.991 2），NFXT為y=0.003 86x+0.002 52（r=0.993 9），SERT為y=0.005 59x+0.031 4（r=0.994 8），F(xiàn)XT、NFXT、SERT檢測質(zhì)量濃度的線性范圍均為5.00～500 ng/mL，定量下限均為5.00 ng/mL。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為5.00 ng/mL（即定量下限）的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和“2.1.5”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為450、250、15.0 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，各5份，于1 d內(nèi)按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)3 d按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，考察日間精密度。以實(shí)測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，用相對誤差（relative erro，RE）考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，各樣品的日內(nèi)、日間RSD均不高于14.0%，RE為-9.6%～14.7%，表明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好[15]。結(jié)果見表2。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.5”項(xiàng)下質(zhì)量濃度分別為450、250、15.0 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，分別于-30 ℃冷凍保存8 d、反復(fù)凍融（-30 ℃～室溫）3次后按“2.2”項(xiàng)下方法處理，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以實(shí)測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，用RE考察準(zhǔn)確度。每樣品平行操作6次。結(jié)果顯示，各樣品的RSD均不高于11.5%，RE為-4.0%～11.0%，表明樣品在上述各種條件下穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表3。

2.4.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察 取“2.1.5”項(xiàng)下質(zhì)量濃度分別為450、250、15.0 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，每質(zhì)量濃度平行6份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積A。取“2.1.3”項(xiàng)下空白胎盤灌流液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，取上清液180 μL作為空白基質(zhì)，加入“2.1.2”項(xiàng)下4 500、2 500、150 ng/mL的質(zhì)控工作溶液各20.0 μL，每質(zhì)量濃度平行6份，按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積B。取水180 μL代替空白胎盤灌流液，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為450、250、15.0 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，每質(zhì)量濃度平行6份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積C。提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。結(jié)果顯示，F(xiàn)XT的平均提取回收率為63.7%～88.8%（RSD≤16.2%），平均基質(zhì)效應(yīng)為73.9%～76.1%（RSD≤20.0%）;NFXT的平均提取回收率為79.4%～112.0%（RSD≤15.0%），平均基質(zhì)效應(yīng)為95.4%～119.0%（RSD≤13.9%）;SERT的平均提取回收率為83.7%～101.0%（RSD≤13.2%），平均基質(zhì)效應(yīng)為96.3%～108.0%（RSD≤12.9%）;內(nèi)標(biāo)的平均提取回收率為92.1%（RSD=12.3%），平均基質(zhì)效應(yīng)為90.1%（RSD=11.0%）。結(jié)果見表4。

2.4.6 殘留效應(yīng)考察 取“2.1.3”項(xiàng)下空白胎盤灌流液180 μL，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為500.0 ng/mL的樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。取空白胎盤灌流液適量，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為0 ng/mL的樣品溶液，同法測定，考察方法的殘留效應(yīng)。每樣品平行測定5次。結(jié)果顯示，空白胎盤灌流液色譜圖中未見明顯色譜峰。

2.5 胎盤透過率的檢測

2.5.1 胎盤納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 本研究中胎盤的納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）經(jīng)陰道自然分娩或剖宮產(chǎn)娩出的新鮮胎盤;（2）足月生產(chǎn)（妊娠37～41周）娩出的新鮮胎盤;（3）結(jié)構(gòu)完整且胎盤小葉無明顯破損，胎膜、羊膜完整的胎盤;（4）無基礎(chǔ)疾病妊娠期婦女娩出的胎盤。排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）經(jīng)人工剝離的胎盤;（2）經(jīng)醫(yī)師判斷需要進(jìn)行病理檢查的胎盤;（3）患有基礎(chǔ)代謝性疾病或傳染性疾病妊娠期婦女娩出的胎盤;（4）分娩超過10 min的胎盤。

2.5.2 胎盤來源及灌注模型建立 在獲取胎盤前已征得妊娠期婦女或家屬知情同意，并與之簽署了胎盤處置告知書。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號為（2016）倫審L第5-1號。選擇2017年3月-2020年9月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供的胎盤，按如下方法建立胎盤灌注模型：根據(jù)胎盤的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，采集剛分娩出的胎盤，選取其中一塊完整的胎盤絨毛小葉，建立母體面和胎兒面（子體面）的雙向循環(huán)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用含目標(biāo)物質(zhì)的胎盤灌流液替代人體血液循環(huán)灌注胎盤小葉，模擬真實(shí)子宮內(nèi)母體和胎兒的血液流動(dòng)情況和內(nèi)環(huán)境，以進(jìn)行母體和胎兒間各種營養(yǎng)物質(zhì)和藥物交換的研究[9，16-18]。單個(gè)胎盤小葉雙向循環(huán)灌注模型示意圖見圖3。

本研究成功建立31個(gè)胎盤灌注模型，其中15個(gè)為FXT、NFXT灌流，10個(gè)為SERT灌流，6個(gè)為安替比林灌流（陽性對照，由于安替比林為小分子親脂性化合物，不與蛋白結(jié)合，可通過被動(dòng)擴(kuò)散經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)，在胎盤灌流實(shí)驗(yàn)中可作為陽性對照以評估模型是否建立成功，也可用于分析不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)是否存在差異[14]）。

2.5.3 胎盤透過率測定 在FXT的灌注實(shí)驗(yàn)中，取“2.1.3”項(xiàng)下母體側(cè)胎盤灌流液，加入鹽酸氟西汀對照品、鹽酸去甲氟西汀對照品，使FXT和NFXT在母體側(cè)胎盤灌流液的起始質(zhì)量濃度均為160 ng/mL;在SERT的灌注實(shí)驗(yàn)中，取“2.1.3”項(xiàng)下母體側(cè)胎盤灌流液，加入鹽酸舍曲林對照品，使SERT在母體側(cè)胎盤灌流液的起始質(zhì)量濃度為100 ng/mL。在上述單一含藥胎盤灌流液中均加入安替比林，使其質(zhì)量濃度為100 μg/mL。單個(gè)胎盤小葉雙向閉合循環(huán)灌注過程共持續(xù)180 min，分別于循環(huán)0、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min時(shí)取子體側(cè)胎盤灌流液樣品和母體側(cè)胎盤灌流液樣品各0.5 mL，分析FXT、NFXT、SERT以及陽性對照安替比林的質(zhì)量濃度（安替比林質(zhì)量濃度檢測方法及其方法學(xué)驗(yàn)證相關(guān)內(nèi)容參考本課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)[14，19]），使用Graphpad Prism 12.0軟件繪制濃度-時(shí)間曲線，并按公式計(jì)算胎盤透過率：胎盤透過率=CF/CM×100%[20]。式中，CF表示子體側(cè)胎盤灌流液樣品各采樣點(diǎn)的藥物濃度，CM表示母體側(cè)胎盤灌流液樣品的最初藥物濃度。結(jié)果顯示，安替比林在灌流3 h后，子體側(cè)胎盤灌流液樣品和母體側(cè)胎盤灌流液樣品的平均胎盤透過率為（37.68±5.87）%，與既往研究報(bào)道的結(jié)果[（36.62±5.08）%]基本一致，表明模型功能良好[14，16-17，21]。灌流3 h后，F(xiàn)XT、NFXT、SERT的平均胎盤透過率分別為（8.74±1.67）%、（10.70±4.81）%、（5.90%±1.25）%，表明FXT、NFXT及SERT均可在子體側(cè)胎盤灌注模型中檢測到，上述3種藥物均可透過胎盤。結(jié)果見圖4、圖5。

3 討論

本課題組前期分別比較了FXT、NFXT及SERT在ESI正、負(fù)離子掃描下的響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者在正離子模式下的響應(yīng)值均為負(fù)離子模式的10倍左右，故選擇檢測模式為正離子模式。與甲醇-5 mmol醋酸銨溶液等流動(dòng)相體系相比，以水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)，且背景噪音有所降低，故選擇水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相。本課題組還比較了等度及梯度洗脫對待測成分色譜保留和靈敏度的影響，結(jié)果顯示，梯度洗脫所得色譜峰峰形良好，靈敏度高，故選擇梯度洗脫;同時(shí)，根據(jù)各待測成分的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，通過摸索最終確定了“2.3.1”項(xiàng)下梯度洗脫程序。此外，本課題組還對不同流速進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí)，待測成分出峰速度過慢;當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，出峰速度雖有所加快，但其離子化效果較差，影響待測成分的離子化與定量分析，故最終選擇流速為0.70 mL/min。通過對色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化，最終確定了“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件，并實(shí)現(xiàn)了待測成分的快速檢測（檢測時(shí)間<4 min）。

目前，藥物暴露量與潛在風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性是臨床應(yīng)用中較為關(guān)注的問題，也是藥物安全性和風(fēng)險(xiǎn)評估的重要參考[8]。藥物胎盤透過率是藥物暴露量的直接評價(jià)指標(biāo)，胎盤透過率高的藥物會(huì)有較高的胎兒暴露量，如果藥物對胎兒的生長發(fā)育存在風(fēng)險(xiǎn)，則容易造成胎兒不良結(jié)局，如死胎、早產(chǎn)、低體質(zhì)量等[9]。Gentile等[22]研究指出，SSRI暴露會(huì)引起胎兒呼吸活動(dòng)改變、心臟血流改變、表觀遺傳學(xué)改變、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素變化等，但該研究并未考慮劑量差異帶來的影響。Mulder等[23]通過B超監(jiān)測SSRI暴露量與胎兒活動(dòng)之間的聯(lián)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康人群或使用低劑量SSRI的妊娠期婦女相比，使用常規(guī)劑量或更大劑量者，其胎兒睡眠受到影響，胎兒活動(dòng)次數(shù)增加，但不同SSRI之間沒有差異。Rurak等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與晨起給藥前相比，峰濃度的SSRI可引起胎兒心率增加、腦動(dòng)脈血流降低等現(xiàn)象。

由于道德和倫理的限制，基于人體的藥物胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)研究難以開展，多以動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，再將實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推于人體，然而由于種屬的差異，導(dǎo)致結(jié)論可能存在爭議。人胎盤體外循環(huán)灌注模型是目前國際上公認(rèn)的物質(zhì)胎盤透過性研究的經(jīng)典方法，也是應(yīng)用較為廣泛的模型之一[9，16-18]。該模型能夠在胎盤完整的前提下，直觀地對藥物胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)程度進(jìn)行研究，其優(yōu)勢包括：（1）胎盤的獲取已征得妊娠期婦女簽字同意，娩出后交予醫(yī)院進(jìn)行處理，不存在倫理和道德爭議;（2）較原代滋養(yǎng)層細(xì)胞等而言，胎盤較易獲得;（3）灌注模型是非侵入性的，相比單細(xì)胞層模型等更接近于人體體內(nèi)生理環(huán)境，可研究胎盤代謝、激素和酶產(chǎn)生及釋放等多種行為[18]。

本研究參考《精神科治療藥物監(jiān)測指南》[25]及相關(guān)文獻(xiàn)[26]，以160 ng/mL FXT、NFXT或100 ng/mL SERT作為母體側(cè)藥物濃度，建立人胎盤灌注模型并進(jìn)行離體循環(huán)灌注研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌流3 h后，F(xiàn)XT、NFXT、SERT的平均胎盤透過率分別為（8.74±1.67）%、（10.70±4.81）%、（5.90%±1.25）%，表明FXT、NFXT、SERT均可透過胎盤。該結(jié)果與體內(nèi)小樣本量研究結(jié)果（當(dāng)給予妊娠期婦女日劑量20 mg的FXT，其FXT與NFXT的臍血/母體濃度比為32%～74%、12%～92%[9，27]）差異較大，推測可能與灌流時(shí)間較短，而FXT、NFXT、SERT在體內(nèi)分布較廣且具有一定的組織蓄積性有關(guān)[28]。胎盤透過性研究結(jié)果表明，F(xiàn)XT與SERT僅有少量透過胎盤，且與FXT相比，SERT的透過率更低，故臨床更傾向于選擇SERT。由于目前國內(nèi)外缺乏對FXT、SERT引起胎兒發(fā)育異常的相關(guān)機(jī)制研究，故后續(xù)需進(jìn)一步考察上述藥物對胎兒發(fā)育的影響，以明確其妊娠期應(yīng)用的安全性。

綜上所述，所建UFLC-MS/MS法操作簡便、靈敏度和準(zhǔn)確度均較高，可用于測定人胎盤灌流液中FXT、NFXT及SERT的濃度。FXT、NFXT、SERT均可透過胎盤，但SERT的胎盤透過率更低。

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（收稿日期：2021-07-26 修回日期：2021-12-10）

（編輯：陳 宏）