雷欣荷 陳昕 孟江 孫悅 王淑美

中圖分類號 R283.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）02-0165-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.07

摘 要 目的 優(yōu)化橘核的鹽炙工藝。方法 以檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量，色差值，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，采用熵權(quán)法進(jìn)行綜合評價，以水鹽比例、悶潤時間、炒制溫度、炒制時間為考察因素，采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化橘核的鹽炙工藝。結(jié)果 最優(yōu)橘核鹽炙工藝為水鹽比例8 ∶ 1（mL/g）、悶潤時間22 min、炒制時間9 min、炒制溫度158 ℃。經(jīng)3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化所得工藝的平均綜合評分為92.35分（RSD=2.19%），與預(yù)測值（93.25分）的相對誤差為1.10%。結(jié)論 所得最優(yōu)鹽炙工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 橘核;鹽炙工藝;熵權(quán)法;星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法;含量測定

Optimization of stir-frying with saltwater technology of Citrus reticulata by entropy weight method combined with central composite design-response surface method

LEI Xinhe，CHEN Xin，MENG Jiang，SUN Yue，WANG Shumei[School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University/Key Lab of Digital Quality Evaluation Technology of Traditional Chinese Medicine， State Administration of Traditional Chinese Medicine/Quality Engineering Technology Research Center of Traditional Chinese Medicine in Colleges and Universities of Guangdong （Provincial） Department of Education，Guangzhou 510006，China]

ABSTRACT ? OBJECTIVE To optimize stir-frying with saltwater technology of Citrus reticulata. METHODS Taking the contents of limonin， nomilin and obacunone， color difference value and free radical scavenging rate of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine （DPPH） as the indexes， the entropy weight method was used for comprehensive evaluation. The stir-frying with saltwater technology of C. reticulata was optimized by central composite design-response surface method by using water-salt ratio， stewing time， frying temperature and frying time as factors. RESULTS The optimal stir-frying with saltwater technology of C. reticulata included water-salt ratio of 8 ∶ 1 （mL/g）， stewing time of 22 min， frying time of 9 min and frying temperature of 158 ℃. After three times of validation tests， the average comprehensive score of the optimized technology was 92.35 （RSD=2.19%）， and its relative error with the predicted value （93.25） was 1.10%. CONCLUSIONS The optimal stir-frying with saltwater technology is stable and feasible.

KEYWORDS ? Citrus reticulata; stir-frying with saltwater technology; entropy weight method; central composite design-response surface method; content determination

橘核為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子，味苦、性平，歸肝、腎經(jīng)，具有理氣、散結(jié)、止痛的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，橘核主要含有檸檬苦素、諾米林、黃柏酮等檸檬苦素類活性成分[2]，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine，DPPH）自由基等活性[3-4]。鹽橘核是橘核通過鹽水拌勻，悶透，再經(jīng)文火炒至微黃而得，炮制后引藥下行，可增強(qiáng)療疝止痛的功效[5]。歷版《中國藥典》、《全國中藥炮制規(guī)范（1988版）》和全國22個省市炮制規(guī)范均收載了橘核的鹽炙法，但均以“用鹽水拌勻，悶透，用文火加熱至微黃并有香氣逸出”的主觀經(jīng)驗(yàn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，未對炮制時間、炮制溫度、飲片顏色等進(jìn)行明確規(guī)定和客觀評價[6];此外，目前關(guān)于橘核鹽炙工藝的研究僅限于以橙皮苷單個成分或檸檬苦素和諾米林兩個成分含量為指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)，指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計均較為局限[7-8]。

色彩色差計是通過模擬人眼視覺系統(tǒng)，結(jié)合儀器模擬積分光學(xué)系統(tǒng)，根據(jù)國際照明委員會Lab顏色空間原理計算得出樣品的色差值明度（L*）、紅綠色軸分量（a*）、黃藍(lán)色軸分量（b*），再對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、統(tǒng)計，得到樣品顏色的色彩范圍，最終實(shí)現(xiàn)對顏色的準(zhǔn)確量化[9-10]。在中藥提取工藝研究中，對多指標(biāo)的綜合評價可直接影響提取工藝參數(shù)的確定，如何在綜合評價中作出合理、科學(xué)的評估，確定各因素的權(quán)重是影響最優(yōu)工藝篩選的關(guān)鍵[11-12]。熵權(quán)法是一種從實(shí)際數(shù)據(jù)出發(fā)，利用指標(biāo)值來反映客觀信息，從而確定權(quán)重的客觀賦權(quán)法[13-14]?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定了鹽橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量;采用色彩色差計對樣品的顏色進(jìn)行客觀、數(shù)字化處理;采用DPPH自由基清除法測定樣品的抗氧化活性;以水鹽比例、悶潤時間、炒制溫度、炒制時間為考察因素，上述各成分含量、色差值、抗氧化活性為指標(biāo)，采用熵權(quán)法進(jìn)行綜合評價，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化橘核的鹽炙工藝，旨在為橘核炮制工藝探索及鹽橘核的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20A型HPLC儀及配備的SPD-20A型檢測器、CTO-10ASVP型柱溫箱、LC Solution 1.26色譜工作站（日本Shimadzu公司），R-410型色彩色差計及配套的白色校正板、粉末測試盒（日本Konica Minolta公司），F(xiàn)LUKE-63型非接觸紅外測溫儀（美國Fluke公司），1530型Multiskan SkyHigh全波段微孔板酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，JP-105A型高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司），JN18C1型電陶爐（浙江歐奔智能科技有限公司），KQ-300DE型超聲波清洗儀（上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

橘核飲片（批號20191103）于2019年11月購自安國市藥源商貿(mào)有限公司，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為蕓香科植物橘C. reticulata Blanco的干燥成熟種子。

檸檬苦素對照品（批號CHB190219）、諾米林對照品（批號CHB180315）、黃柏酮對照品（批號CHB190126）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均大于98%;DPPH試劑（批號D807297）購自上海麥克林生化科技有限公司;食鹽購自廣東省鹽業(yè)集團(tuán)廣州有限公司;磷酸、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 鹽橘核的炮制

按2020年版《中國藥典》（四部）通則“0213鹽炙法”炮制：取橘核50 g，加食鹽1 g，拌勻，悶透，置于鍋內(nèi)，用文火加熱至微黃并有香氣逸出時，取出，放涼[15]。共炮制得10批鹽橘核樣品（編號S1～S10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量測定

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為1.500、2.000、1.000 mg/mL的單一對照品貯備液;分別精密量取上述各單一對照品貯備液560、75、50 μL，置于同一1 mL量瓶中，用甲醇定容，混勻，制得上述成分質(zhì)量濃度分別為840、150、50 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 線性工作溶液的制備 分別精密量取“2.1.1”項下檸檬苦素單一對照品貯備液360、460、560、660、760 μL，諾米林單一對照品貯備液25、50、75、100、125 μL，黃柏酮單一對照品貯備液10、30、50、70、90 μL，置于1 mL量瓶中，用甲醇定容，制得檸檬苦素質(zhì)量濃度分別為540、690、840、990、1 140 μg/mL，諾米林質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250 μg/mL，黃柏酮質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70、90 μg/mL的線性工作溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取鹽橘核樣品適量，粉碎，過三號篩（下同），取粉末1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率50 kHz）提取40 min，取出，冷卻，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 色譜條件 以中譜紅RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～3.5 min，5%A→6%A;3.5～5 min，6%A;5～8 min，6%A→12%A;8～15 min，12%A→45%A;15～30 min，45%A→65%A;30～40 min，65%A→70%A;40～45 min，70%A→95%A）;檢測波長為210 nm;流速為0.8 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液（甲醇），按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可見，各成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)按檸檬苦素峰計均不低于3 000，空白對照溶液對測定無干擾。

2.1.6 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項下線性工作溶液，按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD分別為2.64%、3.47%、2.83%（n=6），表示儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S6），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h時按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD分別為2.91%、4.13%、3.42%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取鹽橘核樣品（編號S6）粉末1 g，共6份，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果顯示，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量的RSD分別為2.82%、3.87%、2.45%（n=6），表示方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的鹽橘核樣品（編號S6）粉末1 g，共6份，分別精密加入檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對照品溶液（配制方法同“2.1.1”項）適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.1.11 樣品含量測定 取鹽橘核樣品粉末，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。

2.2 鹽橘核顏色參數(shù)的測定

2.2.1 測定條件 光源為D65，標(biāo)準(zhǔn)觀察角度為2°，照明口徑為50 mm，儀器誤差在色差值（ΔE*ab）0.6以內(nèi)，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差在ΔE*ab 0.07以內(nèi)。

2.2.2 精密度考察 取鹽橘核樣品（編號S7）粉末，置于色彩色差計中，按“2.2.1”項下測定條件于同日內(nèi)連續(xù)測定6次。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.09%、0.49%、0.29%（n=6），表明方法精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性考察 取鹽橘核樣品（編號S7）粉末，共6份，置于色彩色差計中，按“2.2.1”項下測定條件測定。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.36%、1.98%、1.86%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 樣品穩(wěn)定性考察 取鹽橘核樣品（編號S7）粉末，置于色彩色差計中，按“2.2.1”項下測定條件于同日早上9：00開始，每隔2 h測定1次，連續(xù)測定6次。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.45%、1.99%、2.18%（n=6），表明樣品日內(nèi)穩(wěn)定性良好。取鹽橘核樣品（編號S7）粉末，置于色彩色差計中，分別于放置0、1、2、3、4、5 d時同一時間點(diǎn)，按“2.2.1”項下測定條件測定。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.43%、2.06%、1.80%（n=6），表明樣品日間穩(wěn)定性良好。

2.2.5 樣品色澤測定 取鹽橘核樣品粉末，置于色彩色差計中，按“2.2.1”項下測定條件測定樣品粉末的顏色，每樣品平行測定3次，取平均數(shù)。ΔE*ab=[（Li*-L0*）2+（ai*-a0*）2+（bi*-b0*）2]1/2（式中，L0*、a0*、b0*表示10批鹽橘核飲片的平均值，即標(biāo)準(zhǔn)飲片的色值，Li*、ai*、bi*表示工藝優(yōu)化條件下樣品的色值;ΔE*ab值越小，表示炮制工藝越優(yōu)）[16]。

2.3 鹽橘核抗氧化活性的測定

2.3.1 DPPH工作溶液的配制 稱取DPPH粉末0.019 7 g，置于250 mL量瓶中，加75%乙醇溶解并定容，即得DPPH工作溶液。

2.3.2 提取液的制備 精密稱取鹽橘核樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W、頻率70 kHz）提取50 min，取出，冷卻，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 DPPH自由基清除率的測定 取“2.3.1”項下DPPH工作溶液140 μL、“2.3.2”項下鹽橘核提取液30 μL，混合于96孔板中，振蕩1 min后再于30 ℃下避光反應(yīng)30 min，使用酶標(biāo)儀于517 nm波長處測定吸光度（A1）。以水加等體積的DPPH工作溶液作為空白溶液，同法反應(yīng)后，于517 nm波長處測定吸光度（A0）。取75%乙醇140 μL，加入“2.3.2”項下鹽橘核提取液30 μL，同法反應(yīng)后，于517 nm波長處測定吸光度（A2）。每批鹽橘核樣品均平行測定3次，取平均值。按下式計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%[17]。

2.4 熵權(quán)法分析

熵是系統(tǒng)不確定性和無序程度的度量，可用于確定多指標(biāo)評價系統(tǒng)中各個指標(biāo)的權(quán)重，將每個評價指標(biāo)作為1個隨機(jī)變量，計算該指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)，其值變化程度越大，表示越無序且能提供的信息量越大，該指標(biāo)也就越重要[13]。對于某評價指標(biāo)，若綜合評分越大，即概率（Pi）的信息熵（Hi）越小，權(quán)重系數(shù)（Wi）越大，表明該指標(biāo)處于無序狀態(tài)，在評價中所起的作用越大;反之，則表示該指標(biāo)處于有序狀態(tài)，在綜合評價中不起作用[13]。具體步驟如下：

（1）建立原始評價指標(biāo)矩陣（Xij）：Xij=（Xij）mn。式中，i表示樣品值（i=1，2，……，n），j表示指標(biāo)值（j=1，2，……，m）。

（2）將原始評價指標(biāo)矩陣轉(zhuǎn)為概率矩陣（Pij）：Pij=Xij/[∑][j=1][n]Xij，（0≤Pi≤1）。

（3）計算各項指標(biāo)的Hi：Hi=-k[∑][j=1][n]PijlnPij，k=1/ln（m）。

（4）計算各指標(biāo)的Wi，Wi=1-Hi/[∑][i=1][m]（1-Hi）。

將每個指標(biāo)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理為0～1的歸一值（DI）值，其中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量和DPPH自由基清除率的DI值越大，表示鹽炙工藝越優(yōu);ΔE*ab的DI值越小，表示鹽炙工藝越穩(wěn)定[13]。

2.5 鹽橘核的工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 通過查閱文獻(xiàn)得知鹽炙法的主要影響因素有水鹽比例、悶潤時間、炒制溫度、炒制時間[7-8]，故本研究選擇上述因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。將各單因素考察所得各個指標(biāo)數(shù)據(jù)按“2.4”項下方法對檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，ΔE*ab，DPPH自由基清除率進(jìn)行熵權(quán)法分析，計算得各指標(biāo)的Wi（表3），同時將上述各指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理得到DI值，按下式計算綜合評分（y）：y=（DI檸檬苦素×0.014 4+DI諾米林×0.019 8+DI黃柏酮×0.417 3+DIΔE*ab×0.518 0+DIDPPH自由基清除率×0.030 6）×100。該評分越高，表示鹽炙工藝越優(yōu)[14]。

（1）水鹽比例：取橘核樣品50 g，共5份，分別加入不同比例的水鹽（5 ∶ 1、15 ∶ 2、10 ∶ 1、25 ∶ 2、15 ∶ 1，mL/g）悶潤30 min，于120 ℃炒制7 min，考察不同水鹽比例對綜合評分的影響。結(jié)果顯示，隨著水鹽比例的增加，綜合評分呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)水鹽比例為10 ∶ 1時，綜合評分達(dá)到最高，故選擇水鹽比例為5 ∶ 1～15 ∶ 1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖2A。

（2）悶潤時間：取橘核樣品50 g，共5份，按水鹽比例10 ∶ 1（mL/g）加入鹽水10 mL，悶潤不同時間（15、22.5、30、37.5、45 min）后，于120 ℃炒制7 min，考察不同悶潤時間對綜合評分的影響。結(jié)果顯示，隨著悶潤時間的延長，綜合評分呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)悶潤時間為30 min時，綜合評分達(dá)到最高，故選擇悶潤時間為15～45 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖2B。

（3）炒制溫度：取橘核樣品50 g，共5份，按水鹽比例10 ∶ 1（mL/g）加入鹽水10 mL，悶潤30 min，分別于80、100、120、140、160 ℃下炒制7 min，考察不同炒制溫度對綜合評分的影響。結(jié)果顯示，隨著炒制溫度的增加，綜合評分呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)炒制溫度為120 ℃時，綜合評分達(dá)到最高，故選擇炒制溫度為80～160 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖2C。

（4）炒制時間：取橘核樣品50 g，共5份，按水鹽比例10 ∶ 1（mL/g）加入鹽水10 mL，悶潤30 min，于120 ℃分別炒制3、5、7、9、11 min，考察不同炒制時間對綜合評分的影響。結(jié)果顯示，隨著炒制時間的延長，綜合評分呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)炒制時間為7 min時，綜合評分達(dá)到最高，故選擇炒制時間為3～11 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖2D。

2.5.2 星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化 以水鹽比例（A）、悶潤時間（B）、炒制溫度（C）、炒制時間（D）為考察因素，以檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，ΔE*ab，DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化橘核的鹽炙工藝。

（1）Wi的計算：將工藝優(yōu)化結(jié)果，按“2.4”項下方法對檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，ΔE*ab，DPPH自由基清除率進(jìn)行熵權(quán)分析，計算得到各指標(biāo)的Wi，結(jié)果見表4。由表4可知，ΔE*ab的Wi最大、Hi最小，表明ΔE*ab的變化最大;其次為黃柏酮含量。結(jié)合熵權(quán)法得到的Wj對標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理，得到綜合評分（y）：y=（DI檸檬苦素×0.099 0+DI諾米林×0.141 8+DI黃柏酮×0.381 6+DIΔE*ab×0.466 7+DIDPPH自由基清除率×0.033 4）×100。

（2）星點(diǎn)設(shè)計：橘核鹽炙工藝的因素與水平見表5，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案與結(jié)果見表6。

（3）模型擬合與方差分析：運(yùn)用Design Expert 10軟件對表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并建立二次多元回歸模型，得到綜合評分（y）的二次多元回歸方程為y=130.028 58-3.358 40A+1.647 14B-2.050 73C-6.632 60D+0.008 361AB+0.050 90AC-0.633 56AD-0.007 60BC-0.231 60BD+0.151 16CD-0.039 17A2+0.015 66B2+0.006 30C2+0.186 49D2（P<0.001，R 2=0.923 6）。二次多元回歸模型的F=13.83，P<0.000 1，表示該模型具有顯著性;失擬項中，F(xiàn)=1.89，P=0.224 2，表明失擬項不顯著，說明此模型可以用于分析工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測最優(yōu)工藝。因素C對綜合評分有顯著影響（P<0.01），因素A、B、D對綜合評分無顯著影響（P>0.05），各因素對橘核鹽炙工藝的影響順序?yàn)镃>A>D>B。二次項中，C 2為顯著項（P<0.05），A 2、B 2和D 2為不顯著項（P>0.05），表明因素C與綜合評分并非線性關(guān)系。在交互項中，因素CD為顯著項（P<0.01），表明炒制溫度和炒制時間的交互作用明顯;因素AB、AC、AD、BC、BE的交互作用不顯著（P>0.05），表明除了炒制溫度和炒制時間外，其他因素的交互作用對橘核鹽炙工藝影響不大。結(jié)果見表7。

（4）響應(yīng)面分析及最優(yōu)鹽炙工藝的確定：使用Design Expert 10軟件繪制各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖（圖3）。結(jié)果顯示，因素C與因素D的交互影響作用最強(qiáng)，曲面陡峭，等高線呈橢圓形且密集;因素C與因素A、因素D的交互影響較強(qiáng)，曲面較為陡峭，等高線較密集;因素A與因素B、因素D的交互影響較弱，曲面較平。根據(jù)模型預(yù)測得到橘核的鹽炙工藝為水鹽比例7.8 ∶ 1（mL/g）、悶潤時間21.77 min、炒制時間8.8 min、炒制溫度158 ℃。結(jié)合實(shí)際操作，確定橘核的最優(yōu)鹽炙工藝為水鹽比例8 ∶ 1（mL/g）、悶潤時間22 min、炒制時間9 min、炒制溫度158 ℃。

（5）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取橘核50 g，按上述最優(yōu)鹽炙工藝進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，平均綜合評分為92.35分（RSD=2.19%），與預(yù)測值（93.25分）的相對誤差為1.10%，表明優(yōu)化所得鹽炙工藝穩(wěn)定，可行。結(jié)果見表8。

3 討論

本研究采用HPLC法建立了測定鹽橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量的方法，采用色差計將顏色進(jìn)行客觀、數(shù)據(jù)化處理，并通過測定DPPH自由基清除率得出其抗氧化活性水平，旨在從樣品的外觀顏色、內(nèi)在成分含量、藥效活性等方面出發(fā)，全面客觀地優(yōu)化橘核鹽炙工藝。

2020年版《中國藥典》（一部）未記載橘核中檸檬苦素類成分的含量測定方法[1]。目前文獻(xiàn)報道的用于測定檸檬苦素、諾米林含量的流動相體系有甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氫呋喃-水、乙腈-水-磷酸緩沖液等[8，18-20]。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)流動相為甲醇-磷酸溶液時，各成分分離度較好，基線穩(wěn)定，峰形較好，同時考慮到峰形的對稱性、穩(wěn)定性以及保留時間，最終選擇流動相為甲醇-0.3%磷酸溶液。

有研究表明，檸檬苦素和諾米林的抗氧化活性約為維生素C的2.9～8.3倍[4]，表明兩者的抗氧化活性較強(qiáng)。與等量維生素C相比，檸檬苦素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且其抗氧化活性明顯強(qiáng)于諾米林[21]。在本研究中，鹽橘核對DPPH自由基的平均清除率為0.73，表明鹽橘核對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除活性，這種清除效果可能與其含有檸檬苦素和諾米林有關(guān)[4]。也有研究認(rèn)為，橘核經(jīng)鹽炙和清炒后，其含有的檸檬苦素和諾米林含量較生品顯著下降[2]。因此，鹽橘核與生品橘核的抗氧化能力是否有差別，尚有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，ΔE*ab為0.47～6.14，表明采用不同鹽炙工藝的鹽橘核ΔE*ab變化較大，因此筆者認(rèn)為ΔE*ab可作為橘核鹽炙工藝重點(diǎn)考察的指標(biāo)。

熵權(quán)法可對實(shí)際發(fā)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計算和分析，得出客觀權(quán)重系數(shù)，精度較高，客觀性強(qiáng)，能夠很好地解釋所得結(jié)果[13]。星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法可通過二次多元方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，以回歸方程優(yōu)化工藝參數(shù)，具有精密度高、預(yù)測準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[16]。本課題組采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了水鹽比例、悶潤時間、炒制時間和炒制溫度對橘核鹽炙工藝的影響，并對所得結(jié)果進(jìn)行了熵權(quán)分析，根據(jù)不同炮制方法下各指標(biāo)的變化程度來確定該指標(biāo)的客觀權(quán)重，使得星點(diǎn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案更具科學(xué)性、客觀性。結(jié)果得到橘核的最優(yōu)鹽炙工藝為水鹽比例8 ∶ 1（mL/g）、悶潤時間22 min、炒制時間9 min、炒制溫度158 ℃。優(yōu)化所得工藝的平均綜合評分為92.35分（RSD=2.19%），與預(yù)測值（93.25分）的相對誤差為1.10%，表明該鹽炙工藝穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2021-08-13 修回日期：2021-12-12）

（編輯：陳 宏）