謝炳春，黃俊霖，溫松森，李 濤，李 穎，徐小萬，徐曉美，吳智明，衡 周

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640)

【研究意義】辣椒（Capsicumspp.）是茄科（Solanaceae）辣椒屬（CapsicumL.）植物，原產(chǎn)于中南美洲，是我國種植面積最大的蔬菜［1］。中國辣椒（Capsicum chinenseJacq.）是辣椒5 個主要栽培種之一，其大多數(shù)資源均富含濃郁果香味，具有更豐富的味覺層次，是極好的商品性狀，如海南黃燈籠辣椒［2］、廣西小黃燈籠辣椒［3］和云南涮辣［4］等。據(jù)報道，中國辣椒中果香物質(zhì)主要為3-甲基丁酸-4-甲基戊酯、2-甲基丁酸-4-甲基戊酯和3-甲基丁酸-4-烯-6-甲基庚酯等支鏈酯類物質(zhì)［5］。植物支鏈酯類主要通過支鏈氨基酸途徑合成。BCAT 催化支鏈氨基酸生成相應(yīng)的2-氧代酸［6］，經(jīng)過多步反應(yīng)后合成支鏈酯［8］。研究表明，BCAT基因在辣椒支鏈酯及相關(guān)代謝物合成過程中發(fā)揮著重要作用，因此開展中國辣椒BCAT基因的克隆和時空表達特征分析，對該基因功能研究和提升華南地區(qū)辣椒品質(zhì)育種具有重要意義［8-9］?！厩叭搜芯窟M展】BCAT 作為催化植物支鏈酯類物質(zhì)合成第一步反應(yīng)的酶，受到許多研究重視。2002 年Diebold 等［10］首次鑒定并克隆出擬南芥中6 個BCAT基因并對其進行基因功能驗證，結(jié)果顯示AtBCAT1、AtBCAT2、AtBCAT3、AtBCAT5和AtBCAT6參與支鏈氨基酸合成，AtBCAT2、AtBCAT3、AtBCAT5 蛋白定位于葉綠體，AtBCAT1 蛋白位于線粒體。Schuster 等［11］2005 年使用GUS 染色和酶促動力學(xué)等方法證明AtBCAT1 參與擬南芥所有組織中支鏈氨基酸代謝；2006 年發(fā)現(xiàn)AtBCAT4 參與蛋氨酸的鏈延長途 徑［12］。2008 年Knill 等［13］推 測AtBCAT3 最有可能催化蛋氨酸鏈延長過程中的末端步驟，從而產(chǎn)生短鏈硫代葡萄糖苷。隨后又有研究者相繼對番茄［14］、水稻［6］和小麥［14-15］中的BCAT基因進行功能驗證，相關(guān)基因功能與擬南芥的結(jié)果一致。2014 年郭道義［16］通過聯(lián)合改造酵母的亮氨酸、纈氨酸和脂肪酸途徑，成功實現(xiàn)支鏈醇和支鏈酯的生物合成，目前微生物中BCAT 參與支鏈醇和支鏈酯合成已經(jīng)被研究得比較清楚［17-18］。在乳球菌［19］、甜瓜［20］和香蕉［21］中均有報道顯示其表達量與支鏈酯類含量呈正相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所茄果研究室研發(fā)的辣椒品種金田1 號具有濃郁果香，據(jù)先前預(yù)實驗分析得知其揮發(fā)性有機物質(zhì)主要為支鏈酯，這為中國辣椒支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，前人研究表明BCAT基因參與支鏈酯和辣椒素等次生代謝物的生物合成，但在辣椒中還沒有BCAT基因家族相關(guān)的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過對中國辣椒BCAT基因家族的生物信息學(xué)鑒定、表達模式分析及克隆，明確中國辣椒基因組中BCAT基因的數(shù)目及分布，獲得其BCAT基因時空表達特征及確切序列。本研究是辣椒BCAT功能研究的基礎(chǔ)，可為辣椒支鏈酯類物質(zhì)代謝機理研究提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國辣椒栽培種金田1 號（圖1、圖2），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所茄果研究室李穎提供。2021 年7 月將辣椒種子浸泡12 h后于28℃催芽，露白后播種于裝有專用育苗基質(zhì)的32 孔穴盤，待幼苗長至5～6 片真葉，移栽到廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗基地露地栽培，按常規(guī)田間栽培管理。開花坐果后分別掛牌，每隔5 d取樣1 次，分別取名為F1～F8，設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后帶回實驗室液氮下研磨成粉末保存于–80℃超低溫冰箱。

圖1 辣椒植株Fig.1 Plant of Capsicum chinense

圖2 不同生長時期辣椒果實Fig.2 Different stage of pepper fruit

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒BCAT 家族數(shù)據(jù)獲取與鑒定 由NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載中國辣椒基因組數(shù)據(jù)，查詢相關(guān)文獻已經(jīng)驗證過的BCAT基因的序列信息（表1），在Pfam 網(wǎng)站（https://pfam.xfam.org/search/#tabview=tab1）下載BCAT（PF01063）的hmm 文件，使用HMMER（V3.3.1）軟件和TB Tools（V1.09876）軟件對蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行比對（E-value＜1×10-5，其余參數(shù)默認）。通過在線BLAST、hmmsearch及hmmbuild 和hummsearch 聯(lián)用等手段對辣椒BCAT 基因家族成員進行鑒定。

表1 已鑒定的BCAT 基因Table 1 Identified BCAT genes

1.2.2 辣椒BCAT基因家族成員蛋白理化性質(zhì)、亞細胞定位預(yù)測和染色體定位 辣椒BCAT 蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量大小、等電點、親水性及亞細胞定位預(yù)測分別由在線軟件ExPASy-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和Plant-mPLoc serve（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）完成，染色體分布圖繪制在軟件MapChart 2.32 上完成。

1.2.3 辣椒BCAT基因家族進化樹構(gòu)建 使用MAGA X（Version 10.2.6）軟件對擬南芥、番茄、水稻、小麥和辣椒BCAT 家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（鄰接法，1 000 次重復(fù)）。

1.2.4 辣椒BCAT基因家族成員內(nèi)含子外顯子分析 使用在線工具GSDS2.0（http://gsds.gao-lab.org/）對辣椒BCAT基因家族成員內(nèi)含子外顯子進行分析。

1.2.5 辣椒BCAT家族基因保守基序分析 使用在線軟件MEME（http://memesuite.org/tools/meme）對辣椒BCAT 蛋白進行保守基序（Motif）分析，最大motif 檢索數(shù)值為20。

1.2.6 辣椒BCAT家族基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)分析、活性位點和配體預(yù)測 分別使用在線軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和數(shù)據(jù)庫Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）提交所得蛋白序列，經(jīng)過運算后得到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。使用蛋白質(zhì)活性位點預(yù)測數(shù)據(jù)庫COACH（https://zhanggroup.org/COACH/）對辣椒BCAT 蛋白進行活性位點及配體預(yù)測，提取配體結(jié)合度最高的結(jié)果，使用軟件PyMOL（https://pymol.org/2/）進行修飾，查看BCAT 基因家族成員蛋白的溶劑催化通道。

1.2.7 辣椒BCAT家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析 提取BCAT基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp 序列，利用在線網(wǎng)站Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）結(jié)合TBtool 軟件對BCAT基因家族成員啟動子區(qū)域的順式作用元件進行預(yù)測分析。

1.2.8 辣椒BCAT基因家族成員時空表達量分析 使用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司RNA提取試劑盒提取辣椒根、莖、葉、花和各個時期果實的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM均購自日本TaKaRa 公司，以上所有操作均按照試劑盒說明書進行。反轉(zhuǎn)錄體系使用20 μL 體系，熒光定量PCR 采用25 μL體系，擴增程序為95℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60℃ 30 s，40 個循環(huán)；溶解曲線繪制程序為：65 ℃到95 ℃每0.5℃依次讀板，每個樣品3 次重復(fù)。目標(biāo)基因相對表達量計算使用2–ΔΔCT法。熒光定量PCR引物信息如表2。

1.2.9CcBCAT1～4 基因克隆 根據(jù)CcBCAT1～4基因模板序列于目標(biāo)基因前后設(shè)計帶接頭特異引物（表2），使用cDNA 進行擴增膠回收后連接pNC-Cam1304-SubN 載體［22］。連接好的載體轉(zhuǎn)入Trans5α，菌液PCR 陽性后送北京擎科生物科技有限公司測序。

表2 引物信息Table 2 Information of the primers

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒BCAT 基因家族成員鑒定和進化分析

通過自建隱馬爾可夫模型和下載隱馬爾可夫模型分別得到7 個BCAT基因，去除重復(fù)和保守結(jié)構(gòu)域篩選后鑒定出5 個BCAT基因家族成員，分別命名為CcBCAT1、CcBCAT2、CcBCAT3、CcBCAT4、CcBCAT5。染色體物理位置定位分析顯示，辣椒BCAT1～BCAT5 染色體位置分別位于12、4、2、8 和4 號染色體（圖3）。這些基因位于4 條染色體末端，其中CcBCAT2和CcBCAT5重復(fù)相近地位于4 號染色體上，這兩個基因在表達上可能有所聯(lián)系，其余辣椒BCAT 基因分別位于一條染色體上。

圖3 CcBCATs 基因染色體定位圖Fig.3 Chromosome location of the CcBCAT genes

系統(tǒng)進化分析顯示辣椒BCAT基因的同源性與同為茄科的番茄同源性極高，如SlBCAT1、SlBCAT2和SlBCAT3分別與CcBCAT1、CcBCAT2、CcBCAT3高度同源，可以推測對應(yīng)蛋白質(zhì)具有相似的功能；CcBCAT4則呈現(xiàn)獨立進化；CcBCAT5與AtBCAT1同源性較高（圖4）。

圖4 擬南芥、番茄、水稻小麥和中國辣椒中BCAT 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of BCAT proteins in Arabidopsis,tomato,rice,wheat and Capsicum chinense

辣椒BCAT基因家族成員內(nèi)含子外顯子分析結(jié)果（圖5）表明，BCAT1 和BCAT3 含有9 個內(nèi)含子，BCAT2、BCAT4 和BCAT5 分別含有8、18、4 個內(nèi)含子。BCAT1 的內(nèi)含子序列最長，將近17 kb；BCAT2 的內(nèi)含子序列最短，僅有2 kb左右。

圖5 CcBCATs 基因的結(jié)構(gòu)Fig.5 Structure of CcBCAT genes

2.2 CcBCATs 啟動子區(qū)域順式作用元件分析

啟動子控制著基因的時空表達，對基因的調(diào)控具有重要作用。辣椒BCAT 基因家族成員啟動子順式作用元件如圖6 所示，BCAT基因家族成員啟動子區(qū)域含有14 種啟動子，如光響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件等常見啟動子。BCAT1-5 啟動子區(qū)域均發(fā)現(xiàn)MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

圖6 CcBCAT 基因家族成員啟動子區(qū)域順式元件分析Fig.6 Cis-acting elements analysis for the promoter of CcBCAT gene family members

2.3 CcBCATs 基因家族成員理化性質(zhì)和亞細胞定位預(yù)測

CcBCATs 蛋白的理化性質(zhì)如表3，CcBCATs編碼氨基酸序列長度在184 aa（CcBCAT5）至557 aa（CcBCAT4），分子量 在20 289.41 u（CcBCAT5）至89 598.03 u（CcBCAT4），等電點從5.57（CcBCAT5）至8.34（CcBCAT2），疏水性系數(shù)均為負值，為親水性蛋白。亞細胞定位預(yù)測顯示，CcBCAT1基因編碼的蛋白定位在葉綠體和線粒體，其他CcBCAT 家族基因編碼的蛋白均定位在葉綠體，這與番茄中BCAT基因定位結(jié)果［13］一致。

表3 中國辣椒CcBCAT 基因家族分布及理化性質(zhì)分析Table 3 Basic information of BCAT family genes in Capsicum chinense

2.4 CcBCATs 基因保守基序分析

在線軟件MEME 對CcBCATs 基因保守基序（Motif）分析結(jié)果表明，CcBCAT 蛋白中含有8個保守基序，有著相似的保守基序組成的辣椒BCAT 基因家族成員可能有著相似功能。其中基序4 和基序7 共同組成Aminotran_4 結(jié)構(gòu)域（圖7），除CcBCAT5基因不含有此結(jié)構(gòu)域，其他辣椒BCAT基因家族成員均含有。對應(yīng)MEME 預(yù)測的辣椒中基序1、基序2、基序4 和基序7 均為4 個基因成員含有，其中CcBCAT4 不含基序1 和基序2、CcBCAT5 不含基序4 和基序7。

圖7 CcBCAT 蛋白質(zhì)Motif 分析Fig.7 Protein motif analysis of CcBCAT protein

2.5 CcBCATs 基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

CcBCAT基因家族成員蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖8）表明，5 個基因家族成員均有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4 種結(jié)構(gòu)元件。CcBCAT4 的α-螺旋占比（34.83%）高于其他4 個基因家族成員；CcBCAT5 延伸鏈占比高于其他4 個基因家族成員，β-轉(zhuǎn)角則相反；5個基因家族成員蛋白的無規(guī)則卷曲數(shù)量占比一致（表4）。

圖8 CcBCAT 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果Fig.8 Prediction analysis of the secondary structure of CcBCAT protein

表4 CcBCATs 蛋白二級結(jié)構(gòu)元件Table 4 Secondary structure of CcBCATs proteins

CcBCAT基因家族成員蛋白三級結(jié)構(gòu)、活性位點和配體預(yù)測如圖9 所示，其蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)外型相似，活性位點均在蛋白質(zhì)腔體內(nèi)部。配體預(yù)測結(jié)果顯示BCAT1-4 的配體均為4-甲基-2-氧戊酸，BCAT5 則沒有合適配體。

圖9 CcBCAT 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果Fig.9 Prediction analysis of the tertiary structure of CcBCAT protein

2.6 CcBCAT 基因家族成員時空表達量分析

CcBCAT基因家族成員時空表達量分析如圖10 所示，辣椒BCAT基因家族成員在不同組織表達情況分析發(fā)現(xiàn)：CcBCAT1在F1 期表達量最高，CcBCAT2在花中的表達量最高，CcBCAT3、CcBCAT4在成熟辣椒中表達量最高，CcBCAT5在根、莖、葉、花和果實中均沒有表達。

圖10 CcBCAT 基因在不同組織及果實發(fā)育中的表達情況Fig.10 Expression of CcBCAT genes in different tissues and developing fruits

對BCAT基因家族成員在辣椒果實成熟過程基因表達量進行分析，結(jié)果顯示，CcBCAT1表達量在辣椒果實成熟過程中呈現(xiàn)逐步下調(diào)的趨勢并在成熟果實中達到最低值，CcBCAT2和CcBCAT3的表達量在辣椒發(fā)育過程中呈現(xiàn)先下降后升高并在成熟果實中達到峰值，CcBCAT4表達量在辣椒發(fā)育成熟過程中逐步提升并在成熟果實中達到最高。

2.7 CcBCAT1～CcBCAT4 基因克隆

根 據(jù)CcBCAT1～CcBCAT4的CDS 序列設(shè) 計PCR 特異引物，以cDNA 為模板，對目標(biāo)基因進行PCR 擴增，獲得長度約為2 000 bp 大小的片段（圖11）。片段膠回收，連載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，將PCR 陽性菌落送測序，測序序列與目標(biāo)參考序列進行比對，CcBCAT1、CcBCAT2和CcBCAT4克隆序列與模板序列完全一致；CcBCAT3則顯示第18、23、225 和903 處有單個堿基突變，造成CcBCAT3 氨基酸序列第8 處的纈氨酸（V）變成丙氨酸（A）。

圖11 CcBCAT1～CcBCAT4 基因擴增結(jié)果Fig.11 Amplification result of CcBCAT1～CcBCAT4 genes

3 討論

BCAT基因家族作為一個小基因家族，最早于擬南芥中開始研究，是生物體內(nèi)支鏈氨基酸代謝的重要一環(huán)，對辣椒合成相關(guān)支鏈氨基酸衍生物如辣椒素［23］和支鏈酯［7,24］等應(yīng)對生物及非生物脅迫具有重要意義，在擬南芥［10-11］、番茄［14］、水稻［6］和小麥［15］中均有報道。本研究從中國辣椒基因組中鑒定出5 個BCAT基因，發(fā)現(xiàn)CcBCAT1～CcBCAT3在進化關(guān)系上分別與番茄［14］SlBCA-T1-3 高度同源；CcBCAT4雖然在進化樹位置上呈現(xiàn)獨立進化，但是CcBCAT4的氨基酸序列擁有BCAT 基因的Aminotran_4 結(jié)構(gòu)域，并且配體預(yù)測結(jié)果與4-甲基-2-氧戊酸［7］底物特異性結(jié)合；CcBCAT5則與擬南芥AtBCAT1同源性較高。CcBCAT 亞細胞定位結(jié)果顯示，除CcBCAT1 定位在葉綠體或線粒體，其他均在葉綠體中，符合支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶亞細胞定位結(jié)果［6,14］。因此所鑒定出的5 個CcBCAT基因與經(jīng)過驗證的BCAT［6,10-11,14-15］基因序列特征相似，具有支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白的主要特征。

啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA 序列，決定基因的表達與否。對啟動子的研究有利于了解CcBCAT基因的調(diào)控模式和對外界環(huán)境的響應(yīng)。啟動子順式元件分析顯示，辣椒BCAT基因家族成員基因在啟動子區(qū)域具有多種順式作用元件，包括調(diào)控辣椒素及次生代謝物合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域。MYB 轉(zhuǎn)錄因子是植物中第一大類轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與調(diào)控植物次生代謝物合成，對植物抵御外界生物脅迫［25-27］和非生物脅迫具有重要意義。例如，2014年Li等［28］發(fā)現(xiàn)蘋果MYB1 和MYB6 可以與蘋果AAT2 啟動子區(qū)域的MYB 位點結(jié)合，增強其轉(zhuǎn)錄活性；2019年Zhu 等［29］發(fā)現(xiàn)MYB31基因能激活辣椒合成途徑相關(guān)基因，使辣椒素得以合成積累，2022 年Zhang 等［30］對辣椒素合成途徑相關(guān)基因啟動子區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)多個功能基因上游均有MYB 結(jié)合位點。還有研究發(fā)現(xiàn)，蘋果中BCAT 參與了蘋果支鏈酯合成［31］。結(jié)合本研究結(jié)果和已有文獻推測，CcBCAT 可能在辣椒素和相關(guān)酯類物質(zhì)合成中起到重要作用。

基因的表達量是影響蛋白表達豐度進而影響相應(yīng)酶功能的重要因素。對CcBCAT基因的表達分析顯示其存在組織特異性表達，且在果實的不同發(fā)育時期表達規(guī)律也有所差異。CcBCAT5 雖然有完整的開放閱讀框、能編碼完整的蛋白，但是在所有組織器官中均檢測不到表達，這一結(jié)果與番茄中SlBCAT5-6 表達模式［32］一致。但CcBCAT5是否是一個假基因還需要進一步驗證。CcBCAT4 僅在辣椒花和果實中有表達，并且隨著果實的生長表達量不斷提高，與辣椒素積累量［33］、辣椒揮發(fā)性有機物質(zhì)積累量呈正相關(guān)，推測其參與中國辣椒的辣椒素合成，該結(jié)果與Zhang 等［30］、Zhang 等［34］和Kim 等［23］研究結(jié)果一致，而番茄果實中BCAT 則一直呈現(xiàn)低水平表達［14］。CcBCAT2 和CcBCAT3 的表達模式相似，辣椒果實發(fā)育時兩者的表達量變化一致，CcBCAT2 和CcBCAT3 兩者之間有可能與擬南芥AtBCAT3-4的關(guān)系［12-13］相似，參與蛋氨酸碳鏈延長步驟中的一環(huán)，不過兩者的功能和相關(guān)性還需要更多實驗數(shù)據(jù)進行支撐。

4 結(jié)論

通過生物信息學(xué)的方法鑒定出中國辣椒基因組中5 個BCAT 基因，并對其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、活性位點、配體和時空表達特異性等進行分析，克隆出CcBCAT1～CcBCAT4等4 個關(guān)鍵基因。結(jié)果表明中國辣椒BCAT 基因家族是一個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的小基因家族，除CcBCAT5可能是個假基因，其他基因的表達均有特異性，如CcBCAT4在辣椒果實中表達模式與辣椒素和相關(guān)揮發(fā)性代謝物積累模式一致，有可能參與支鏈氨基酸衍生物合成。本研究將有利于推進辣椒支鏈氨基酸代謝研究，為辣椒風(fēng)味品質(zhì)提升提供數(shù)據(jù)支持。