張大勇，王象然,2，吳雨恒，赫晨宇，楊柳，賈璐，莊靜而

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院/國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系佳木斯綜合試驗(yàn)站/三江平原主要作物育種栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007）

大豆是我國主要油料及經(jīng)濟(jì)作物，富含優(yōu)質(zhì)植物蛋白及油脂，是食品加工及畜禽飼料重要來源[1]。其品質(zhì)改善和產(chǎn)量提高是當(dāng)代大豆育種家共同育種目標(biāo)。光合作用是促使作物干物質(zhì)形成主要途徑，將二氧化碳和水同化并生成有機(jī)物同時(shí)釋放氧氣[2]。葉綠素是光合作用關(guān)鍵色素，對作物產(chǎn)量形成具有重要影響[3]。

大豆中葉綠素含量是影響光合速率重要因素，二者呈正相關(guān)趨勢[4]。而光合速率與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)[5]，因此葉綠素含量測定對預(yù)測和提高大豆產(chǎn)量至關(guān)重要。崔世友等利用151個(gè)RIL家系在4個(gè)不同生育時(shí)期下結(jié)合大豆籽粒產(chǎn)量分析葉綠素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在生育后期大豆葉綠素含量與籽粒產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)[6]。張恒善利用400多份大豆品種，測定其葉綠素含量（a+b），按年度、熟期分組與產(chǎn)量作相關(guān)分析，結(jié)果表明各組相關(guān)程度不同，總體呈正相關(guān)趨勢[7]。全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association analysis，GWAS）是目前發(fā)現(xiàn)復(fù)雜農(nóng)藝性狀基因變異的有效新策略。Rish等首次提出全基因組關(guān)聯(lián)分析概念[8]，在糧食、經(jīng)濟(jì)、油料等作物中得到廣泛運(yùn)用[9]。薦紅舉等以588份重測序油菜種質(zhì)資源為材料，連續(xù)兩年測定其苗期葉綠素含量并通過全基因組關(guān)聯(lián)分析最終得到23個(gè)候選基因，其中4個(gè)基因參與葉綠素合成途徑，BnaA10g02050D（BnaPOR C）基因與氧化還原酶活性有關(guān)，編碼原葉綠素氧化還原酶；BnaC02g01240D（BnaHEMC）基因編碼膽色素原脫氨酶參與血紅素生物合成；BnaC05g38600D（Bna-HEME2）基因與血紅素代謝相關(guān)；BnaC09g54390D（BnaHEMG2）基因與氧化還原酶活性有關(guān)，編碼原卟啉原氧化酶2[10]。史大坤等以538份玉米自交系構(gòu)成的關(guān)聯(lián)群體為研究對象，利用GWAS解析玉米葉綠素含量遺傳基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因參與葉綠素代謝，GRMZM2G178859（COX10）基因參與血紅素生物合成過程；GRMZM2G168858（CPR2）基因具有鐵氧還蛋白還原酶型FAD結(jié)合域，編碼NADPH-細(xì)胞色素p450還原酶[11]。樊慶琦等在缺鐵脅迫下對小麥苗期葉片葉綠素含量進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在對照未受脅迫條件下得到23個(gè)顯著SNP位點(diǎn)，并認(rèn)為在3B染色體上發(fā)現(xiàn)4個(gè)顯著SNP與葉綠素合成相關(guān)[12]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析在大豆遺傳分析中應(yīng)用日益廣泛[13]。Wen等對兩個(gè)大豆群體進(jìn)行基因分型共獲得52 041個(gè)SNP，通過對單株莢數(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析檢測到1個(gè)顯著相關(guān)SNP（Gm01-55794390）[14]。張友誼以224份大豆微核心種質(zhì)為試驗(yàn)材料，對多個(gè)與產(chǎn)量有關(guān)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)的36個(gè)基因位點(diǎn)[15]。

近年來，學(xué)者多利用全基因組關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行大豆抗性性狀及產(chǎn)量方面的研究，對大豆葉綠素含量遺傳基礎(chǔ)方面研究也僅限基于雙親本分離群體進(jìn)行QTL定位分析[16]。由此可見，除大多數(shù)在生理生化水平上測定大豆葉綠素含量外，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對大豆葉綠素相關(guān)基因定位研究較少。

本研究以196份國內(nèi)外大豆種質(zhì)資源組成的自然群體為試驗(yàn)材料，測定大豆葉片葉綠素含量，并結(jié)合高密度SNP標(biāo)記，運(yùn)用混合線性模型（Mixed linear model）作全基因組關(guān)聯(lián)分析，對影響大豆葉綠素含量相關(guān)基因進(jìn)行預(yù)測與篩選，為探究大豆葉綠素含量遺傳機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)方法

該群體于2021年5月種植于黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽試驗(yàn)示范基地，每小區(qū)60行，行長3 m，行距65 cm，株距6 cm，同當(dāng)?shù)卮筇锾镩g管理。

1.2.2 表型數(shù)據(jù)采集

對該自然群體每一個(gè)株行中隨機(jī)選取第五片三出復(fù)葉完全展開且長勢相同的連續(xù)5株，選取頂部第四片三出復(fù)葉中間小葉，利用慧諾瑞德（北京）科技有限公司多功能植物測量儀MultispeQ在其完全伸展的葉片中間部位測定SPAD值（葉綠素相對含量），重復(fù)3次，3次測量均值作為該葉片葉綠素含量；5株對應(yīng)葉片葉綠素含量均值作為該品種對應(yīng)葉片葉綠素含量，并用于后續(xù)表型一般統(tǒng)計(jì)分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析。

續(xù)表

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2016對大豆自然群體葉綠素含量統(tǒng)計(jì)分析并剔除離群值，利用SPSS 22.0分析基因相對表達(dá)量數(shù)據(jù)并作獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

1.2.4 基因型鑒定

以往學(xué)者將孟子性善論理解為“孟子認(rèn)為人性是善的”，實(shí)際上《孟子》一書中只說“孟子道性善”“言性善”，而后者是不能等同于“人性是善的”。如果一定要用命題表述的話，也應(yīng)表述為：人皆有善性；人應(yīng)當(dāng)以此善性為性；人的價(jià)值和意義即在于充分?jǐn)U充與實(shí)現(xiàn)自己的性。

材料通過Illumina HiSeqTM測序平臺進(jìn)行測序，流程按照Illumina公司提供標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議執(zhí)行。對獲得的59 071個(gè)SNP標(biāo)記按等位基因頻率條件（maf）＜0.05進(jìn)行質(zhì)量篩選共獲得52 391個(gè)高質(zhì)量SNP。利用Haploview 4.2軟件對質(zhì)控后SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析，劃分單倍型塊。

1.2.5 群體結(jié)構(gòu)親緣關(guān)系分析

在RStudio中采用GAPIT軟件[17]對該自然群體進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系分析。

1.2.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析

GWAS分析在RStudio中利用GAPIT軟件MLM模型作分析[17]。

1.2.7 候選基因篩選

根據(jù)大豆參考基因組，在獲得葉片葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記上下游各100 kb內(nèi)搜索基因，利用網(wǎng)站（https://www.soybase.org/）對所搜索到的基因進(jìn)行GO分子功能注釋，利用網(wǎng)站（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）對搜索到的基因進(jìn)行KEGG途徑注釋，將已獲得基因與擬南芥基因進(jìn)行序列對比（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/），進(jìn)行功能注釋以篩選與葉綠素含量相關(guān)的候選基因。

1.2.8 表達(dá)量分析

設(shè)計(jì)候選基因的qRT-PCR引物序列（http://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb），引物序列由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成（見表1）。

表1 葉綠素含量相關(guān)候選基因引物Table 1 Primers of candidate genes related to chlorophyll content

根據(jù)各品種葉綠素含量，在葉綠素含量高低兩類極端材料中連續(xù)選擇各10個(gè)品種，選取苗期葉片提取RNA（Simgen公司UItra Pure Total RNA Extration Kit試劑盒），設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（Simgen公司cDNA第一鏈合成試劑盒）。使用Gene Copoeia公司BlazeTaqTM SYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒進(jìn)行候選基因相對表達(dá)量驗(yàn)證。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，在Bio-Rad CFX96定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆自然群體葉綠素含量表型分析

對196份大豆品種構(gòu)成的自然群體，隨機(jī)選取長勢相同的連續(xù)5株，選取頂部第四片三出復(fù)葉的中間小葉，測定其完全伸展的葉片中間部位葉綠素含量。該自然群體綠素平均含量為49.37，含量變化范圍在39.48～58.57，標(biāo)準(zhǔn)差為3.12，變異系數(shù)為6.31%，偏度值和峰度值為-0.26和0.16，并且偏度值和峰度值絕對值均小于1，說明葉綠素含量出現(xiàn)連續(xù)正態(tài)分布，符合多基因控制的數(shù)量性狀特征，結(jié)果如圖1所示。

圖1 大豆自然群體葉片葉綠素含量頻次分布Fig.1 Frequency distribution of chlorophyll content in leaves of soybean natural population

2.2 大豆自然群體結(jié)構(gòu)評價(jià)

分析該自然群體的群體結(jié)構(gòu)，PCA主成分分析結(jié)果表明該自然群體無明顯分層，種質(zhì)間親緣關(guān)系均衡，從親緣關(guān)系Kinship圖也可看出，群體間無顯著群體結(jié)構(gòu)。選前3個(gè)主成分作協(xié)變量對群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行校正，結(jié)果如圖2所示。

圖2 主成分和大豆遺傳數(shù)據(jù)親緣關(guān)系分析Fig.2 Principal component and kinship analyses of soybean genetic data

2.3 大豆自然群體葉綠素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用GAPIT對該自然群體葉綠素含量采用MLM模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，并繪制Manhattan圖與QQ-Plot，結(jié)果如圖3所示。

圖3 葉綠素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析Manhattan圖與QQ-Plot Fig.3 Manhattan graph and QQ-Plot of genome wide association analysis on chlorophyll content

設(shè)P=0.5/52 391為顯著關(guān)聯(lián)SNP閾值，共篩選得到顯著SNP共37個(gè)，分別位于2、3、4、7、10、13、16號染色體上。其中2號染色體上存在4個(gè)SNP；3號染色體上存在26個(gè)SNP；4號染色體上存在1個(gè)SNP；7號染色體上存在2個(gè)SNP；10號染色體上存在1個(gè)SNP；13號染色體上存在1個(gè)SNP；16號染色體上存在2個(gè)SNP，結(jié)合Block進(jìn)行分類，結(jié)果見表2。

表2 葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)Table 2 SNP sites significantly associated with chlorophyll content

2.4 大豆自然群體葉綠素含量候選基因預(yù)測

對閾值以上SNP位點(diǎn)在其上下游各100 kb范圍內(nèi)根據(jù)大豆基因組數(shù)據(jù)庫搜索到基因194個(gè)，通過GO功能富集分析以及KEGG代謝通路富集分析，與擬南芥基因進(jìn)行序列對比，根據(jù)前人研究的擬南芥同源基因功能，篩選出可能影響葉綠素含量基因11個(gè)，結(jié)果見表3。其中2號染色體1個(gè)；3號染色體2個(gè)；7號染色體3個(gè)；10號染色體3個(gè)；13號染色體1個(gè)；16號染色體1個(gè)。

表3 葉綠素含量候選基因以及注釋信息Table 3 Candidate genes and annotation information for chlorophyll content

2.5 候選基因熒光定量分析

將篩選出的11個(gè)基因在葉綠素含量差異極端的兩類材料中驗(yàn)證相對表達(dá)量，結(jié)果見表4。

表4 品種名稱及葉綠素含量Table 4 Variety name and chlorophyll content

結(jié)合T檢驗(yàn)分析結(jié)果得出4個(gè)基因Glyma.02G185300、Glyma.03G085000、Glyma.10G259900、Glyma.16G037100在兩類材料中具有顯著差異，結(jié)果如圖4所示。

圖4 大豆葉綠素含量候選基因定量分析Fig.4 Quantitative analysis of candidate genes for soybean chlorophyll content

相對于低葉綠素含量材料中，4個(gè)基因在高葉綠素含量材料中基因表達(dá)量相對較高。其中包括Glyma.10G259900編碼TXND9與細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)，介導(dǎo)四吡咯生物合成并參與葉綠素合成；Glyma.02G185300編碼葉綠體NTRC參與葉綠素代謝與光周期生長調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

葉綠素合成代謝過程十分復(fù)雜，本研究以196份國內(nèi)外大豆品種組成的自然群體為試驗(yàn)材料，結(jié)合高密度SNP位點(diǎn)，對葉綠素含量進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，通過GO功能富集分析、KEGG代謝通路富集分析、基因功能注釋以及qRT-PCR篩選鑒定出4個(gè)與大豆葉綠素含量相關(guān)候選基因。葉綠素屬于四吡咯物質(zhì)，基因Glyma.10G259900具有硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，編碼硫氧還蛋白，存在于從胞膜到類囊體腔的所有葉綠體隔室中，介導(dǎo)四吡咯生物合成，直接參與葉綠素代謝[18]，這一研究結(jié)果與史大坤等研究理論相符合[11]?；騁lyma.02G185300具有硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，編碼葉綠體NADPH硫氧還蛋白還原酶（NTRC），NTRC是一種高效氧化還原系統(tǒng)，為保護(hù)植物葉綠體免受氧化損傷，可控制包括葉綠素生物合成的關(guān)鍵代謝和調(diào)節(jié)途徑，且與擬南芥光周期生長控制之間具有聯(lián)系[19-20]，其他作物中與該基因功能及結(jié)構(gòu)相似的相關(guān)候選基因尚未見報(bào)道。這兩個(gè)基因同屬于硫氧還蛋白（Trx）家族，研究表明該家族參與光合作用、葉綠素含量調(diào)控[21-22]?；騁lyma.16G037100屬于肽酶M50家族，編碼EGY1金屬蛋白酶，是葉綠體發(fā)育必需基因，參與葉綠體發(fā)育和光合作用過程，如影響捕光復(fù)合物I和II（Lhca和Lhcb）的葉綠素a/b結(jié)合蛋白的積累，該蛋白定位在葉綠體膜、類囊體膜上參與光捕獲[23]，在其他作物中與之功能及結(jié)構(gòu)特征相似的相關(guān)候選基因尚未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，肽酶M50家族基因具有影響葉綠體發(fā)育以及葉綠素含量的功能[24]。在3號染色體上檢測到的編碼細(xì)胞色素P450的基因Glyma.03G085000（CYP82C4），細(xì)胞色素P450超家族（CYP）是一大類血紅素蛋白。血紅素與葉綠素是具有不同金屬元素的化合物，結(jié)構(gòu)與特征相似。CYP通過將氧氣還原為水（使用NADH或NADPH）催化有機(jī)物質(zhì)氧化，并與金屬攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)[25]，這一結(jié)果與史大坤等在玉米中研究結(jié)果與葉綠素相關(guān)基因功能相似[11]，有研究表明該基因家族在葉綠素含量調(diào)控方面發(fā)揮作用[26-27]。本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對影響大豆葉綠素含量基因進(jìn)行預(yù)測，為探究大豆葉綠素含量遺傳機(jī)理提供理論參考。為進(jìn)一步探究與大豆葉綠素含量相關(guān)候選基因，后期將對候選基因功能進(jìn)行有效驗(yàn)證，為大豆分子育種提供有效依據(jù)。