張大勇，王象然,2，吳雨恒，赫晨宇，楊柳，賈璐，莊靜而

（1.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業(yè)科學院佳木斯分院/國家大豆產業(yè)技術體系佳木斯綜合試驗站/三江平原主要作物育種栽培重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007）

大豆是我國主要油料及經濟作物，富含優(yōu)質植物蛋白及油脂，是食品加工及畜禽飼料重要來源[1]。其品質改善和產量提高是當代大豆育種家共同育種目標。光合作用是促使作物干物質形成主要途徑，將二氧化碳和水同化并生成有機物同時釋放氧氣[2]。葉綠素是光合作用關鍵色素，對作物產量形成具有重要影響[3]。

大豆中葉綠素含量是影響光合速率重要因素，二者呈正相關趨勢[4]。而光合速率與產量呈顯著正相關[5]，因此葉綠素含量測定對預測和提高大豆產量至關重要。崔世友等利用151個RIL家系在4個不同生育時期下結合大豆籽粒產量分析葉綠素含量，結果發(fā)現(xiàn)在生育后期大豆葉綠素含量與籽粒產量呈極顯著正相關[6]。張恒善利用400多份大豆品種，測定其葉綠素含量（a+b），按年度、熟期分組與產量作相關分析，結果表明各組相關程度不同，總體呈正相關趨勢[7]。全基因組關聯(lián)分析（Genome wide association analysis，GWAS）是目前發(fā)現(xiàn)復雜農藝性狀基因變異的有效新策略。Rish等首次提出全基因組關聯(lián)分析概念[8]，在糧食、經濟、油料等作物中得到廣泛運用[9]。薦紅舉等以588份重測序油菜種質資源為材料，連續(xù)兩年測定其苗期葉綠素含量并通過全基因組關聯(lián)分析最終得到23個候選基因，其中4個基因參與葉綠素合成途徑，BnaA10g02050D（BnaPOR C）基因與氧化還原酶活性有關，編碼原葉綠素氧化還原酶；BnaC02g01240D（BnaHEMC）基因編碼膽色素原脫氨酶參與血紅素生物合成；BnaC05g38600D（Bna-HEME2）基因與血紅素代謝相關；BnaC09g54390D（BnaHEMG2）基因與氧化還原酶活性有關，編碼原卟啉原氧化酶2[10]。史大坤等以538份玉米自交系構成的關聯(lián)群體為研究對象，利用GWAS解析玉米葉綠素含量遺傳基礎，發(fā)現(xiàn)兩個基因參與葉綠素代謝，GRMZM2G178859（COX10）基因參與血紅素生物合成過程；GRMZM2G168858（CPR2）基因具有鐵氧還蛋白還原酶型FAD結合域，編碼NADPH-細胞色素p450還原酶[11]。樊慶琦等在缺鐵脅迫下對小麥苗期葉片葉綠素含量進行全基因組關聯(lián)分析，在對照未受脅迫條件下得到23個顯著SNP位點，并認為在3B染色體上發(fā)現(xiàn)4個顯著SNP與葉綠素合成相關[12]。

全基因組關聯(lián)分析在大豆遺傳分析中應用日益廣泛[13]。Wen等對兩個大豆群體進行基因分型共獲得52 041個SNP，通過對單株莢數(shù)進行全基因組關聯(lián)分析檢測到1個顯著相關SNP（Gm01-55794390）[14]。張友誼以224份大豆微核心種質為試驗材料，對多個與產量有關性狀進行全基因組關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與產量相關聯(lián)的36個基因位點[15]。

近年來，學者多利用全基因組關聯(lián)分析進行大豆抗性性狀及產量方面的研究，對大豆葉綠素含量遺傳基礎方面研究也僅限基于雙親本分離群體進行QTL定位分析[16]。由此可見，除大多數(shù)在生理生化水平上測定大豆葉綠素含量外，利用全基因組關聯(lián)分析對大豆葉綠素相關基因定位研究較少。

本研究以196份國內外大豆種質資源組成的自然群體為試驗材料，測定大豆葉片葉綠素含量，并結合高密度SNP標記，運用混合線性模型（Mixed linear model）作全基因組關聯(lián)分析，對影響大豆葉綠素含量相關基因進行預測與篩選，為探究大豆葉綠素含量遺傳機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 田間試驗方法

該群體于2021年5月種植于黑龍江省哈爾濱市東北農業(yè)大學向陽試驗示范基地，每小區(qū)60行，行長3 m，行距65 cm，株距6 cm，同當?shù)卮筇锾镩g管理。

1.2.2 表型數(shù)據(jù)采集

對該自然群體每一個株行中隨機選取第五片三出復葉完全展開且長勢相同的連續(xù)5株，選取頂部第四片三出復葉中間小葉，利用慧諾瑞德（北京）科技有限公司多功能植物測量儀MultispeQ在其完全伸展的葉片中間部位測定SPAD值（葉綠素相對含量），重復3次，3次測量均值作為該葉片葉綠素含量；5株對應葉片葉綠素含量均值作為該品種對應葉片葉綠素含量，并用于后續(xù)表型一般統(tǒng)計分析和全基因組關聯(lián)分析。

續(xù)表

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2016對大豆自然群體葉綠素含量統(tǒng)計分析并剔除離群值，利用SPSS 22.0分析基因相對表達量數(shù)據(jù)并作獨立樣本T檢驗。

1.2.4 基因型鑒定

以往學者將孟子性善論理解為“孟子認為人性是善的”，實際上《孟子》一書中只說“孟子道性善”“言性善”，而后者是不能等同于“人性是善的”。如果一定要用命題表述的話，也應表述為：人皆有善性；人應當以此善性為性；人的價值和意義即在于充分擴充與實現(xiàn)自己的性。

材料通過Illumina HiSeqTM測序平臺進行測序，流程按照Illumina公司提供標準協(xié)議執(zhí)行。對獲得的59 071個SNP標記按等位基因頻率條件（maf）＜0.05進行質量篩選共獲得52 391個高質量SNP。利用Haploview 4.2軟件對質控后SNP進行連鎖不平衡分析，劃分單倍型塊。

1.2.5 群體結構親緣關系分析

在RStudio中采用GAPIT軟件[17]對該自然群體進行群體結構、親緣關系分析。

1.2.6 全基因組關聯(lián)分析

GWAS分析在RStudio中利用GAPIT軟件MLM模型作分析[17]。

1.2.7 候選基因篩選

根據(jù)大豆參考基因組，在獲得葉片葉綠素含量顯著關聯(lián)的SNP標記上下游各100 kb內搜索基因，利用網站（https://www.soybase.org/）對所搜索到的基因進行GO分子功能注釋，利用網站（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）對搜索到的基因進行KEGG途徑注釋，將已獲得基因與擬南芥基因進行序列對比（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/），進行功能注釋以篩選與葉綠素含量相關的候選基因。

1.2.8 表達量分析

設計候選基因的qRT-PCR引物序列（http://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb），引物序列由睿博興科生物技術有限公司合成（見表1）。

表1 葉綠素含量相關候選基因引物Table 1 Primers of candidate genes related to chlorophyll content

根據(jù)各品種葉綠素含量，在葉綠素含量高低兩類極端材料中連續(xù)選擇各10個品種，選取苗期葉片提取RNA（Simgen公司UItra Pure Total RNA Extration Kit試劑盒），設置3次生物學重復。將提取的RNA反轉錄合成cDNA（Simgen公司cDNA第一鏈合成試劑盒）。使用Gene Copoeia公司BlazeTaqTM SYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒進行候選基因相對表達量驗證。每個樣品設置3次重復，在Bio-Rad CFX96定量PCR儀上進行qRT-PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 大豆自然群體葉綠素含量表型分析

對196份大豆品種構成的自然群體，隨機選取長勢相同的連續(xù)5株，選取頂部第四片三出復葉的中間小葉，測定其完全伸展的葉片中間部位葉綠素含量。該自然群體綠素平均含量為49.37，含量變化范圍在39.48～58.57，標準差為3.12，變異系數(shù)為6.31%，偏度值和峰度值為-0.26和0.16，并且偏度值和峰度值絕對值均小于1，說明葉綠素含量出現(xiàn)連續(xù)正態(tài)分布，符合多基因控制的數(shù)量性狀特征，結果如圖1所示。

圖1 大豆自然群體葉片葉綠素含量頻次分布Fig.1 Frequency distribution of chlorophyll content in leaves of soybean natural population

2.2 大豆自然群體結構評價

分析該自然群體的群體結構，PCA主成分分析結果表明該自然群體無明顯分層，種質間親緣關系均衡，從親緣關系Kinship圖也可看出，群體間無顯著群體結構。選前3個主成分作協(xié)變量對群體結構進行校正，結果如圖2所示。

圖2 主成分和大豆遺傳數(shù)據(jù)親緣關系分析Fig.2 Principal component and kinship analyses of soybean genetic data

2.3 大豆自然群體葉綠素含量全基因組關聯(lián)分析

利用GAPIT對該自然群體葉綠素含量采用MLM模型進行全基因組關聯(lián)分析，并繪制Manhattan圖與QQ-Plot，結果如圖3所示。

圖3 葉綠素含量全基因組關聯(lián)分析Manhattan圖與QQ-Plot Fig.3 Manhattan graph and QQ-Plot of genome wide association analysis on chlorophyll content

設P=0.5/52 391為顯著關聯(lián)SNP閾值，共篩選得到顯著SNP共37個，分別位于2、3、4、7、10、13、16號染色體上。其中2號染色體上存在4個SNP；3號染色體上存在26個SNP；4號染色體上存在1個SNP；7號染色體上存在2個SNP；10號染色體上存在1個SNP；13號染色體上存在1個SNP；16號染色體上存在2個SNP，結合Block進行分類，結果見表2。

表2 葉綠素含量顯著關聯(lián)SNP位點Table 2 SNP sites significantly associated with chlorophyll content

2.4 大豆自然群體葉綠素含量候選基因預測

對閾值以上SNP位點在其上下游各100 kb范圍內根據(jù)大豆基因組數(shù)據(jù)庫搜索到基因194個，通過GO功能富集分析以及KEGG代謝通路富集分析，與擬南芥基因進行序列對比，根據(jù)前人研究的擬南芥同源基因功能，篩選出可能影響葉綠素含量基因11個，結果見表3。其中2號染色體1個；3號染色體2個；7號染色體3個；10號染色體3個；13號染色體1個；16號染色體1個。

表3 葉綠素含量候選基因以及注釋信息Table 3 Candidate genes and annotation information for chlorophyll content

2.5 候選基因熒光定量分析

將篩選出的11個基因在葉綠素含量差異極端的兩類材料中驗證相對表達量，結果見表4。

表4 品種名稱及葉綠素含量Table 4 Variety name and chlorophyll content

結合T檢驗分析結果得出4個基因Glyma.02G185300、Glyma.03G085000、Glyma.10G259900、Glyma.16G037100在兩類材料中具有顯著差異，結果如圖4所示。

圖4 大豆葉綠素含量候選基因定量分析Fig.4 Quantitative analysis of candidate genes for soybean chlorophyll content

相對于低葉綠素含量材料中，4個基因在高葉綠素含量材料中基因表達量相對較高。其中包括Glyma.10G259900編碼TXND9與細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)相關，介導四吡咯生物合成并參與葉綠素合成；Glyma.02G185300編碼葉綠體NTRC參與葉綠素代謝與光周期生長調控。

3 討論與結論

葉綠素合成代謝過程十分復雜，本研究以196份國內外大豆品種組成的自然群體為試驗材料，結合高密度SNP位點，對葉綠素含量進行全基因組關聯(lián)分析，通過GO功能富集分析、KEGG代謝通路富集分析、基因功能注釋以及qRT-PCR篩選鑒定出4個與大豆葉綠素含量相關候選基因。葉綠素屬于四吡咯物質，基因Glyma.10G259900具有硫氧還蛋白結構域，編碼硫氧還蛋白，存在于從胞膜到類囊體腔的所有葉綠體隔室中，介導四吡咯生物合成，直接參與葉綠素代謝[18]，這一研究結果與史大坤等研究理論相符合[11]?；騁lyma.02G185300具有硫氧還蛋白結構域，編碼葉綠體NADPH硫氧還蛋白還原酶（NTRC），NTRC是一種高效氧化還原系統(tǒng)，為保護植物葉綠體免受氧化損傷，可控制包括葉綠素生物合成的關鍵代謝和調節(jié)途徑，且與擬南芥光周期生長控制之間具有聯(lián)系[19-20]，其他作物中與該基因功能及結構相似的相關候選基因尚未見報道。這兩個基因同屬于硫氧還蛋白（Trx）家族，研究表明該家族參與光合作用、葉綠素含量調控[21-22]?；騁lyma.16G037100屬于肽酶M50家族，編碼EGY1金屬蛋白酶，是葉綠體發(fā)育必需基因，參與葉綠體發(fā)育和光合作用過程，如影響捕光復合物I和II（Lhca和Lhcb）的葉綠素a/b結合蛋白的積累，該蛋白定位在葉綠體膜、類囊體膜上參與光捕獲[23]，在其他作物中與之功能及結構特征相似的相關候選基因尚未見報道。研究發(fā)現(xiàn)，肽酶M50家族基因具有影響葉綠體發(fā)育以及葉綠素含量的功能[24]。在3號染色體上檢測到的編碼細胞色素P450的基因Glyma.03G085000（CYP82C4），細胞色素P450超家族（CYP）是一大類血紅素蛋白。血紅素與葉綠素是具有不同金屬元素的化合物，結構與特征相似。CYP通過將氧氣還原為水（使用NADH或NADPH）催化有機物質氧化，并與金屬攝取/轉運密切相關[25]，這一結果與史大坤等在玉米中研究結果與葉綠素相關基因功能相似[11]，有研究表明該基因家族在葉綠素含量調控方面發(fā)揮作用[26-27]。本研究利用全基因組關聯(lián)分析對影響大豆葉綠素含量基因進行預測，為探究大豆葉綠素含量遺傳機理提供理論參考。為進一步探究與大豆葉綠素含量相關候選基因，后期將對候選基因功能進行有效驗證，為大豆分子育種提供有效依據(jù)。