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        高分子量透明質(zhì)酸抑制橫紋肌肉瘤細胞遷移的初步研究

        2022-02-07 06:47:04蘇靜艷鄭景賢趙亞浩佟慧麗
        東北農(nóng)業(yè)大學學報 2022年12期
        關(guān)鍵詞:檢測

        蘇靜艷,鄭景賢,趙亞浩,佟慧麗*

        (1.東北農(nóng)業(yè)大學細胞與遺傳工程黑龍江省重點實驗室,哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院細胞與發(fā)育生物學實驗室,哈爾濱 150030)

        透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成,是重復二糖單元組成的多糖,屬于氨基聚糖家族,作為細胞外基質(zhì)重要成分,廣泛存在于人體組織。1 MDa以上透明質(zhì)酸被定義為高分子量HA(High molecular weight hyaluronic acid,HMW-HA)。HMW-HA具有抗增殖、抗氧化、抗腫瘤和抗血管生成特性,參與傷口愈合[1-2]。正常生理狀態(tài)下,透明質(zhì)酸以高分子量形式存在,在病理情況如炎癥發(fā)生時,透明質(zhì)酸降解為小分子,發(fā)揮抗炎、抗細菌感染等作用[3-4]。透明質(zhì)酸通過結(jié)合細胞表面各種受體分子如CD44、HMMR、LAYN等發(fā)揮生物學活性[5-6]。對CD44高表達的實體腫瘤,化學修飾后的透明質(zhì)酸和基于透明質(zhì)酸的納米載體可用于化療藥物遞送,增強藥物作用潛能及細胞毒性,獲得較好抗腫瘤作用[7]。

        此外,不同生物個體中透明質(zhì)酸以不同分子量范圍存在,裸鼴鼠是目前壽命最長的嚙齒類動物,與其他哺乳動物相比,可產(chǎn)生超高分子量的透明質(zhì)酸(>6.1 MDa),研究表明超高分子量的透明質(zhì)酸通過抑制其受體CD44與其他蛋白相互作用下調(diào)p53基因表達,使小鼠和人類細胞免受應激誘導的細胞周期停滯和細胞死亡[8]。同時裸鼴鼠體內(nèi)超高分子量透明質(zhì)酸的存在,使其體內(nèi)細胞產(chǎn)生接觸抑制,并抵抗癌癥發(fā)生[9],近年來引發(fā)學界關(guān)注。因此推測高分子量的透明質(zhì)酸抗癌效果較好。

        橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RMS)是兒童和青少年中最常見的(約50%)軟組織肉瘤,是一種以早期肌源性分化為特征的惡性腫瘤[10]。其惡性程度高,侵襲和轉(zhuǎn)移能力強,放化療效果不理想,易復發(fā),預后不良,是臨床治療難題。本文通過研究高分子量透明質(zhì)酸(1.2 MDa)抑制橫紋肌肉瘤細胞遷移,旨在為高分子量透明質(zhì)酸在抗腫瘤研究中提供新的思路和策略,具有廣闊的應用前景和價值。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        本試驗采用的RD(人惡性胚胎橫紋肌瘤細胞)(CL-0193)購自武漢普諾賽生命科技有限公司,采用RD細胞專用培養(yǎng)基(CM-0193)培養(yǎng)細胞。

        1.2 試驗試劑及儀器

        高分子量透明質(zhì)酸(1.2 MDa,9004-61-9,中國)。Cdc42抗體(bs-3555R,博奧森,中國),Arp2/3抗體(bs-10563R,博奧森,中國),GAPDH抗體(10494-1-AP,Proteintech,中國)。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(bs-0925GHRP,博奧森,中國)。Cy5標記的小鼠抗兔二抗(bs-0369M-Cy5,博奧森,中國)。甘氨酸、Tris、聚丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、胰蛋白酶、PBS溶液(Sigma,美國),微絲綠色熒光探針Actin-Tracker Green(C1033)、RIPA Buffer細胞裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、超敏型抗熒光淬滅劑、細胞核染料DAPI、Tween 20、Trition-X-100、牛血清白蛋白BSA(碧云天,中國),PVDF膜、超敏型曝光液(Millpore,美國),其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

        生物超凈工作臺(蘇州安泰,中國),電子分析天平(Mettler Toledo,瑞士),超低溫冰箱(SANYO,日本),雙板垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(北京六一,中國),CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國),倒置顯微鏡(Olympus,日本),化學發(fā)光成像儀(MiniChemiTM 500,Sage Creation Science,中國),超高分辨顯微鏡(Deltavision OMX SR,GE,美國)。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 細胞劃痕試驗

        將RD細胞接種于6孔板中,待細胞貼壁后,用100 μL移液管尖端均勻繪制無細胞區(qū)域,用PBS清洗細胞3次以去除細胞碎片,補充新鮮培養(yǎng)基(不含血清)。拍照記錄細胞生長情況,37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h后,再次對細胞拍照,采用Image J分析細胞劃痕面積,細胞遷移率:

        遷移率(%)=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100。

        1.3.2 高分子量透明質(zhì)酸的細胞添加試驗

        采用PBS磷酸鹽緩沖液稀釋高分子量透明質(zhì)酸至濃度為1 μg·μL-1(透明質(zhì)酸工作液)。取貼壁生長的RD細胞,去除舊的細胞生長培養(yǎng)液,以PBS清洗細胞后,加入新鮮細胞生長培養(yǎng)液和高分子量透明質(zhì)酸的混合溶液,充分混勻,其中透明質(zhì)酸終濃度分別為50、100和200 μg·mL-1。對照組向細胞中添加PBS和新鮮生長培養(yǎng)液的混合溶液。以6孔板為例(單孔細胞培養(yǎng)液總體積為2 mL),試驗組和對照組藥品添加量如表1所示。將添加高分子量透明質(zhì)酸或者PBS對照的細胞放置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用于后續(xù)熒光定量,Western blot檢測及細胞免疫熒光試驗。

        表1 高分子量透明質(zhì)酸的細胞添加試驗Table 1 Cell addition test of HMW-HA

        1.3.3 實時熒光定量PCR檢測

        本研究采用SYBGreen實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)法檢測高分子量透明質(zhì)酸對RD細胞中不同透明質(zhì)酸受體mRNA的表達情況。具體流程為RNA提取,反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR檢測。①RNA提?。翰捎肨RIZOL試劑(Invitrogen)提取RD細胞總RNA。②反轉(zhuǎn)錄:采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(R211-01,南京諾唯贊,中國)進行細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄試驗,用于雙鏈cDNA合成。③熒光定量PCR:采用SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q111-02,南京諾唯贊,中國)說明配制RTPCR反應體系。

        引物序列如表2所示。反應體系為:SYBR q PCR Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol)各0.5 μL,cDNA模板2 μL,補水至20 μL。反應條件為:95℃預變性30 s,95℃變性10 s,60℃退火和延伸30 s,40個循環(huán)。每個樣品進行3次平行試驗。以GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCT法計算不同透明質(zhì)酸受體mRNA相對表達量。

        表2 不同HA受體熒光定量引物序列Table 2 Fluorescence quantitative primer sequences of different HA receptors

        1.3.4 Western blot檢測

        采用標準試驗流程進行Western blot檢測,簡述如下:以預冷PBS清洗細胞3次。棄去PBS,加入RIPA Buffer細胞裂解液對細胞進行蛋白質(zhì)提取。采用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液稀釋收集的蛋白樣品。隨后,進行SDS-PAGE聚丙酰胺凝膠電泳試驗,通過蛋白印記系統(tǒng),將聚丙烯凝膠上分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(200 mA,恒流2 h)。分別采用CD44、cdc42、Arp2/3、和GAPDH等一抗稀釋液孵育PVDF膜(4℃,12 h),使用PBST(PBS+0.2% Tween 20)清洗PVDF膜3次,以HRP標記的山羊抗兔二抗孵育PVDF膜(37℃,1 h),PBST清洗3次后,采用化學發(fā)光成像儀對蛋白條帶進行圖像采集和分析。一抗和二抗稀釋倍數(shù)分別采用說明書推薦的最佳比例。

        1.3.5 細胞免疫熒光染色

        采用PBS清洗貼壁的RD細胞鋪片,隨后以4%多聚甲醛于室溫下固定細胞,20 min后,棄去固定液。用PBS清洗細胞3次后,加入5%BSA的PBST(PBS+0.1%Triton)進行透膜和封閉處理(37℃,1 h)。棄去5%BSA的PBST(PBS+0.1%Triton),以CD44一抗稀釋液(以5%BSA的PBST稀釋抗體)孵育細胞(4℃,12 h),采用PBST清洗細胞3次,棄去清洗液,加入Cy5標記的小鼠抗兔二抗稀釋液避光孵育細胞(37℃,1 h),采用PBST清洗細胞3次并棄去清洗液。采用Actin-Tracker Green染料稀釋液避光孵育細胞30 min,采用PBST清洗細胞3次并棄去清洗液,采用DAPI細胞核染料孵育細胞10 min,采用PBST清洗細胞3次,吸凈清洗液后,將細胞鋪片倒扣于預先滴加抗熒光猝滅封片劑的載玻片上,使用超高分辨顯微鏡對細胞中CD44表達和微絲分布進行觀察和拍照。一抗和二抗稀釋倍數(shù)分別采用說明書推薦的最佳比例。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        采用Image J軟件掃描Western blot圖片灰度及分析細胞遷移率,所有試驗數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism軟件統(tǒng)計。采用SPSS(SPSS Inc.Chicago IL,USA)分析數(shù)據(jù)差異顯著性。相關(guān)數(shù)據(jù)使用t檢驗進行差異顯著性分析。ns代表不同處理組之間無統(tǒng)計學差異;*代表不同處理之間差異顯著(P<0.05),**代表不同處理組之間差異極顯著(P<0.01)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 高分子量透明質(zhì)酸細胞劃痕試驗

        本研究采用不同濃度高分子量透明質(zhì)酸處理RD細胞,分別于作用0和24 h記錄RD細胞遷移情況(見圖1A)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明不同濃度的透明質(zhì)酸(50、100和200 μg·mL-1)均可極顯著抑制RD細胞遷移(P<0.01),其中200 μg·mL-1透明質(zhì)酸抑制效果最明顯(見圖1B)。表明高分子量透明質(zhì)酸可抑制RD細胞遷移,以200 μg·mL-1濃度透明質(zhì)酸用于后續(xù)試驗。

        圖1 高分子量透明質(zhì)酸對RD細胞遷移的影響Fig.1 Effects of high molecular weight hyaluronic acid on RD cell migration

        2.2 不同透明質(zhì)酸受體mRNA表達的熒光定量PCR檢測

        采用200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理RD細胞,48 h后收集細胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA,并采用SYBRGreen熒光定量PCR法檢測7種主要的透明質(zhì)酸受體mRNA表達情況。檢測結(jié)果表明不同透明質(zhì)酸受體在RD細胞中呈現(xiàn)不同的表達量。其中CD44和HMMR具有較高的表達量,且在高分子量透明質(zhì)酸處理后CD44和HMMR的mRNA表達量均顯著下調(diào)。而其他幾種透明質(zhì)酸受體LAYN、HARE、Siglec9、TLR2和TLR4表達水平較低,高分子量透明質(zhì)酸處理對上述幾種受體的表達無顯著影響(見圖2)。CD44和HMMR在RD細胞中高表達,在透明質(zhì)酸處理時表達量發(fā)生顯著變化,表明CD44和HMMR可能作為高分子量透明質(zhì)酸發(fā)揮作用的主要受體,在抑制RD細胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。

        圖2 不同透明質(zhì)酸受體mRNA表達的熒光定量PCR檢測Fig.2 Detection of the mRNA expression of hyaluronic acid receptors by real-time fluorescence quantitative PCR

        2.3 高分子量透明質(zhì)酸對RD細胞遷移相關(guān)蛋白表達的影響

        為進一步闡明高分子量透明質(zhì)酸抑制RD細胞遷移的機理。本研究采用Western blot檢測CD44及細胞遷移相關(guān)蛋白表達情況。檢測結(jié)果顯示,與mRNA表達的熒光定量檢測結(jié)果一致,200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理RD細胞48 h后,CD44蛋白表達量與對照組相比顯著下調(diào)(見圖3A,B)。同時透明質(zhì)酸處理組的細胞遷移相關(guān)蛋白cdc42和Arp2/3表達量亦顯著下調(diào)(見圖3A,C,D)。上述結(jié)果表明,高分子量透明質(zhì)酸處理引起CD44表達量下調(diào),通過下調(diào)cdc42和Arp2/3表達而影響微絲聚合,阻礙RD細胞遷移。

        圖3 高分子量透明質(zhì)酸對RD細胞遷移相關(guān)蛋白表達的影響Fig.3 Protein expression related to cell migration impacted by high molecular weight hyaluronic acid in RD cells

        2.4 高分子量透明質(zhì)酸對RD細胞中CD44定位及微絲分布的影響

        本研究采用細胞免疫熒光染色技術(shù)對RD細胞中CD44蛋白表達及微絲分布情況進行共定位染色。超高分辨顯微鏡觀察結(jié)果顯示CD44蛋白分布在RD細胞質(zhì)膜區(qū)域,200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理后,紅色陽性熒光信號分布及強度顯著減少和減弱(見圖4)。微絲分布定位的熒光染色(綠色信號)結(jié)果顯示,對照組細胞中,在CD44高表達的細胞質(zhì)膜區(qū)域,微絲在局部聚集呈分枝狀,提示此處微絲裝配為細胞偽足并促進細胞遷移。高分子量透明質(zhì)酸處理48 h后,細胞體積增大且伸展,同時CD44表達量降低,微絲呈現(xiàn)應力纖維的分布狀態(tài)(見圖4B)。此外,光學顯微鏡的觀察結(jié)果顯示200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理RD細胞48 h后,并未影響RD細胞活性及狀態(tài)(見圖4A)。

        圖4 高分子量透明質(zhì)酸對RD細胞中CD44定位及微絲分布的影響Fig.4 CD44 localization and microfilament distribution in RD cells impacted by high molecular weight hyaluronic acid

        上述結(jié)果表明,CD44表達變化可能參與調(diào)節(jié)微絲動態(tài)裝配過程,通過影響偽足形成而降低細胞遷移運動。

        3 討論

        為明確高分子量透明質(zhì)酸在RD細胞中可能的作用受體,本研究采用熒光定量RT-PCR法檢測不同透明質(zhì)酸的表達受體,HMMR、LAYN、HARE、Siglec9、TLR2和TLR4,結(jié)果表明CD44在RD細胞中表達水平最高,高分子量透明質(zhì)酸處理顯著下調(diào)CD44表達。Western blot蛋白表達的檢測結(jié)果與熒光定量結(jié)果相符,即高分子量透明質(zhì)酸可下調(diào)CD44蛋白表達水平,提示在RD細胞中,CD44可能作為高分子量透明質(zhì)酸作用的靶點而影響細胞行為。

        CD44屬于單次跨膜的非激酶型糖蛋白,其在胚胎干細胞及多種細胞類型包括結(jié)締組織和骨髓中表達[11]。CD44在多種癌細胞中表達上調(diào)并認為是腫瘤干細胞的標志分子[12]。透明質(zhì)酸作為CD44配體,通過結(jié)合CD44胞外結(jié)構(gòu)域,將細胞信號傳遞至CD44胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域,激活細胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導途徑,引起細胞增殖、黏附、遷移及侵襲[13]。研究表明,腫瘤細胞發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)時,CD44表達上調(diào)[14]。臨床病理學研究表明CD44可能是癌癥治療新靶點[15]。此外,CD44在維持腫瘤干細胞干性和治療后腫瘤再生中發(fā)揮促進作用,提示其可能是一個重要腫瘤預后標志分子[16]。研究表明,橫紋肌肉瘤組織中CD44表達與患者預后直接相關(guān)[17]。但CD44在橫紋肌肉瘤進展中作用尚不明確。

        細胞劃痕試驗結(jié)果表明,不同濃度高分子量透明質(zhì)酸特別是200 μg·mL-1可顯著抑制RD細胞遷移。免疫熒光染色的超高分辨觀察結(jié)果表明,CD44高表達時,細胞內(nèi)微絲主要集中在緊貼細胞質(zhì)膜的細胞質(zhì)區(qū)域,交聯(lián)為絲狀或分枝狀的結(jié)構(gòu),表明其可能作為細胞絲狀或片狀偽足參與細胞遷移和運動。Rho家族小GTP酶作為分子開關(guān),可調(diào)節(jié)細胞遷移和運動。Rho家族小GTP酶包括3個家族成員:Rac,Cdc42和Rho[18]。其中,Cdc42位于細胞運動前端,參與細胞遷移極性和方向。細胞外信號可在特定方向上激活細胞質(zhì)膜附近的Cdc42,使細胞產(chǎn)生極性,發(fā)展為細胞運動前緣,同時可使微管骨架和內(nèi)膜系統(tǒng)也產(chǎn)生極化。Cdc42通過WASP蛋白激活Arp2/3復合物,刺激分枝狀微絲(片狀偽足)的裝配,而片狀偽足是推動細胞前緣向前運動的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[19]。研究表明Arp2/3復合物通過誘導肌動蛋白聚合為微絲,對促進細胞黏附、遷移和侵襲至關(guān)重要,增強腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和擴散能力[20]。

        研究結(jié)果顯示,CD44高表達時,微絲主要以絲狀或分枝狀形式存在于細胞質(zhì)膜前端,推測其與RD細胞較強遷移能力有關(guān)。高分子量透明質(zhì)酸處理后,CD44表達量極低,微絲改變其分布形式,貫穿于整個細胞,以應力纖維形式存在,使細胞形態(tài)更為鋪展,提示其可能抑制細胞遷移,與蛋白表達檢測結(jié)果相符,即CD44表達下調(diào)同時,Cdc42和Arp2/3表達量也顯著降低,提示高分子量透明質(zhì)酸處理可影響RD細胞偽足形成,抑制細胞遷移。但高分子量透明質(zhì)酸為何下調(diào)CD44表達,是否通過轉(zhuǎn)錄水平抑制CD44表達,以及RD細胞中微絲分布變化與CD44表達關(guān)系的詳細分子機制,仍待深入探索。高分子量透明質(zhì)酸對于RD細胞遷移的抑制,可為研究腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和運動遷移提供新思路,具有重要應用價值。

        4 結(jié)論

        高分子量透明質(zhì)酸可降低RD細胞中透明質(zhì)酸受體CD44表達,通過抑制細胞偽足形成而抑制RD細胞遷移和運動,為橫紋肌肉瘤疾病治療提供新策略。

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