張定秋，蘇 燕，杜 鋼，蔣珍菊

(1.西華大學(xué)，四川成都 610039；2.四川食品檢驗(yàn)研究院，四川成都 611700)

喹諾酮類獸藥因具有吸收快、見效好、毒性較低等特點(diǎn)，被廣泛用于畜禽病患的預(yù)防和治療[1-2]。但如果不恰當(dāng)使用此類抗生素藥物，容易導(dǎo)致殘留在受體動(dòng)物內(nèi)，經(jīng)過食物鏈傳遞而進(jìn)入人體內(nèi)，可能導(dǎo)致人體對該類藥物產(chǎn)生耐藥性[3]。世界各國相繼出臺了喹諾酮類多種獸藥的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，我國農(nóng)業(yè)部第235 號和2292號公告對獸藥的使用及限量也進(jìn)行了明確規(guī)定[4]。目前，動(dòng)物性食品中喹諾酮類獸藥殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5-8]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[9-12]、熒光偏振免疫分析(FPIA)[13]和膠體金免疫層析方法[14]等。由于食品特別是動(dòng)物食品及制品基質(zhì)的復(fù)雜性，在前處理凈化后并不能有效地去除樣品基質(zhì)的干擾，這嚴(yán)重影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，因此基質(zhì)干擾問題是食品檢測人最關(guān)注的問題[15-16]。檢測方法的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)隨前處理方法、樣品種類、基質(zhì)濃度和獸藥濃度等因素的變化而變化，并影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[17]。

QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)是一種快速、簡單、廉價(jià)、高效、可靠和安全的分散固相萃取技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥、獸藥的殘留檢測[18-23]，但是目前該前處理技術(shù)應(yīng)用于檢測肉類食品(雞肉、豬肉)中喹諾酮類獸藥殘留的報(bào)道不多。筆者為降低基質(zhì)效應(yīng)，以市售生豬肉和雞肉為例，采用EMR-Lipid 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管，提升供試溶液潔凈度[24]，建立QuEChERS-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定豬肉和雞肉中環(huán)丙沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、洛美沙星、氧氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和司帕沙星共9喹諾酮類獸藥殘留的分析方法，并將其結(jié)果與現(xiàn)行國家食品安全檢測方法GB/T 21312—2007[25]檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試劑。環(huán)丙沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、洛美沙星、氧氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和司帕沙星共9種標(biāo)準(zhǔn)品(均為固體)，均購于天津阿爾塔科技有限公司。甲醇、乙腈、正己烷、二甲亞砜，色譜純，Thermo Fisher Scientific；甲酸、乙酸，色譜純，CNW Technologies；醋酸銨、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉，分析純，成都市科龍化工試劑廠；EMR-Lipid、EMR-Polish粉包，分析純，Agilent Technologies；超純水；有機(jī)系微孔濾膜(13 mm×0.22 μm)，天津億鼎鑫分析儀器有限公司。

1.1.2試材。樣品來源于市場抽樣。

1.1.3儀器與設(shè)備。Agilent1290-6495高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，Mettler ToledoBSA423S和 XS204 電子天平，IKA MS3digital渦旋儀，Thermo Heraeus X3R 離心機(jī)，Thermo Legend Micro 17R離心機(jī)，IRM AS1511519超聲機(jī)，Caliper Tyrbovap LV氮吹儀，Mettler ToledoS220-K酸度計(jì)，Waters固相萃取儀，Merck MilliporMilli-Q超純水機(jī)，Eppendorf 20 μL、100 μL、1 000 μL、5 mL可調(diào)量程移液器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制。分別精密稱取9種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約10.0 mg，用乙腈溶解、定容至10 mL，配制成1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，保存于2～8 ℃冰箱。臨用前分別取儲(chǔ)備液0.1 mL，用乙腈定容、配制濃度為1 μg/mL的中間液。再用15%乙腈-水溶液依次稀釋，配制成1.00、2.50、10.00、50.00、100.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.2.2QuEChERS方法。稱取均質(zhì)后樣品(雞肉、豬肉)5 g(精確至0.01 g)，放置50 mL離心管中，加入 5% 甲酸乙腈提取液10.0 mL，再加2顆陶瓷均質(zhì)子，2 000 r/min渦旋混勻 5 min，5 000 r/min離心 5 min；移取 5.0 mL提取液到經(jīng)過活化的EMR-Lipid dSPE管中，快速振搖并渦旋 2 min(2 000 r/min)，再5 000 r/min離心 5 min；將上層液轉(zhuǎn)移至 50.0 mL 離心管中，加2顆陶瓷均質(zhì)子及3.5 g EMR-Polish粉包，劇烈、快速振搖并渦旋 2 min(2 000 r/min)后離心 5 min(5 000 r/min)；取 2 mL 上層溶液至玻璃試管中，加入 0.050 mL 二甲亞砜以防止在40 ℃下氮?dú)鉂饪s時(shí)溶液被吹干，濃縮至剩余液體約 0.050 mL向試管中加入 0.950 mL 15% 乙腈-水溶液，2 000 r/min渦旋10 s，超聲輔助處理10 s，2 000 r/min渦旋 1 min；將前處理后的溶液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，10 000 r/min離心 2 min，有機(jī)系微孔濾膜過濾，將濾液收集至15 mL離心管中，待分析。同理制得空白基質(zhì)溶液，按照“1.2.1”方法配制相同濃度基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，待分析。

1.2.3國家食品安全檢測方法。與GB/T 21312—2007方法一致，并制得空白基質(zhì)溶液，按照“1.2.1”方法配制相同濃度基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1色譜條件。Agilent 1290高效液相色譜儀，Agilent 6495型串聯(lián)質(zhì)譜儀。色譜柱為安捷倫 C18柱(3.0 mm×150 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A為0.2%甲酸水，B為0.2%甲酸乙腈；梯度洗脫程序見表1；流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；運(yùn)行時(shí)間26 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.2質(zhì)譜條件。電離模式為ESI(正模式)；檢測方式為動(dòng)態(tài)多反應(yīng)離子監(jiān)測(dMRM)；電離電壓為3.5 kV；干燥氣流速為13 L/min；干燥氣溫度為150 ℃；鞘氣流速為12 L/min；鞘氣溫度為300 ℃；霧化器流量為241.32 kPa。

1.3.3質(zhì)譜參數(shù)。以2 μL/min 的流速注入200 ng/mL的9種喹諾酮類獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜掃描，篩選出最佳母離子掃描的條件，再對母離子進(jìn)行掃描，以信號最強(qiáng)的離子對作為定量離子對，以信號次強(qiáng)的離子對作為定性離子對，得到9種喹諾酮類獸藥質(zhì)譜參數(shù)，詳見表2。

表2 質(zhì)譜采集參數(shù)及保留時(shí)間Table 2 Mass spectrum acquisition parameters and retention time

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS提取溶劑的選擇提取溶液中酸濃度升高會(huì)使蛋白質(zhì)快速成團(tuán)，從而影響目標(biāo)獸藥的提取。在相同提取步驟下進(jìn)行3組提取溶劑，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行連續(xù)測定2次，第1、2、3組分別用10.0 mL乙腈、3% 甲酸乙腈、5% 甲酸乙腈進(jìn)行提取，其余的凈化、除水、氮吹和復(fù)溶等所有操作完全一致。不同加標(biāo)濃度在雞肉基質(zhì)和豬肉基質(zhì)中回收率平均值(n=2)比較見圖1～2。結(jié)果表明采取5% 甲酸乙腈提取，9種喹諾酮類獸藥響應(yīng)值最高、峰形更尖銳、回收率更佳。

圖1 3種提取試劑在不同加標(biāo)濃度的雞肉基質(zhì)回收率比較Fig.1 Comparison of recovery rates of three extraction reagents in chicken substrate with different spiked concentrations

圖2 3種提取試劑在不同加標(biāo)濃度的豬肉基質(zhì)回收率比較Fig.2 Comparison of recovery rates of three extraction reagents in pork substrate with different spiked concentrations

2.2 方法檢驗(yàn)

2.2.1線性范圍和檢出限。按照“1.2.1”方法處理質(zhì)量濃度梯度為1.00、2.50、5.00、10.00、50.00、100.00 ng/mL的基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“1.3”條件進(jìn)行檢測，以加標(biāo)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)、定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以QuEChERS技術(shù)前處理后，HPLC-MS/MS檢測結(jié)果表明，9種喹諾酮類獸藥在雞肉和豬肉基質(zhì)中濃度在1～100 ng/mL 線性關(guān)系良好(R2>0.998)，線性回歸方程和決定系數(shù)見表3～4。結(jié)合空白基質(zhì)噪音響應(yīng)，以信噪比S/N=3確定方法的檢出限(LOD)，雞肉基質(zhì)檢出限為0.5 μg/kg、豬肉基質(zhì)檢出限為0.2 μg/kg。

表3 雞肉基質(zhì)線性方程和決定系數(shù)Table 3 Linear equation and determination coefficient of chicken matrix

表4 豬肉基質(zhì)線性方程和決定系數(shù)Table 4 Linear equation and determination coefficient of pork matrix

2.2.2準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證QuEChERS技術(shù)測定9種喹諾酮類獸藥殘留在豬肉和雞肉中的可行性和準(zhǔn)確性，以已檢測過的陰性樣品的空白雞肉基質(zhì)樣品和空白豬肉基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率驗(yàn)證，加標(biāo)量梯度分別為2.5、10.0、100.0 μg/kg，按照“1.2.2”方法用QuEChERS技術(shù)處理，重復(fù)試驗(yàn)6次，再計(jì)算平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表5～6。從表5～6可以看出，空白雞肉基質(zhì)樣品平均回收率為80.7%～115.3%，RSD為0.02%～1.01%；空白豬肉基質(zhì)樣品平均回收率為75.0%～116.3%，RSD為0.08%～3.32%，方法的準(zhǔn)確度和精密度符合實(shí)驗(yàn)室測定需求[25]。

加標(biāo)水平為50.0 μg/kg的雞肉基質(zhì)和豬肉基質(zhì)，分別在時(shí)間間隔2、4、6、8、12和24 h測得9種獸藥的RSD在2.6%以內(nèi)和2.9%以內(nèi)，表明9種獸藥在雞肉和豬肉中的穩(wěn)定性滿足試驗(yàn)測定要求。

表5 雞肉基質(zhì)加標(biāo)回收率和RSD(n=6)Table 5 Recovery rate and RSD of chicken matrix

表6 豬肉基質(zhì)加標(biāo)回收率和RSD(n=6)Table 6 Recovery rate and RSD of pork matrix

2.3 基質(zhì)效應(yīng)按照Matuszewski等[26]提出的提取后添加法定量評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)，即基質(zhì)效應(yīng)在85%～115%則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。在相同色譜和質(zhì)譜參數(shù)條件下，雞肉樣品和豬肉樣品分別采用QuEChERS方法和 GB/T 21312—2007方法測得的基質(zhì)效應(yīng)比較見圖3。從圖3可以看出，QuEChERS方法基質(zhì)效應(yīng)在85%～115%，優(yōu)于國家食品安全檢測方法 GB/T 21312—2007，可視為無基質(zhì)效應(yīng)。

圖3 雞肉基質(zhì)(a)和豬肉基質(zhì)(b)2種不同方法基質(zhì)效應(yīng)比較Fig.3 Comparison of substrate effects between chicken substrate(a)and pork substrate(b)by two different methods

EMR-Lipid 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管能有效去除樣品基質(zhì)中脂肪等物質(zhì)，提升供試溶液潔凈度，降低基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)也增強(qiáng)了低濃度獸藥的信噪比和峰面積響應(yīng)值，確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度[18]。

2.3.1信噪比比較。在相同色譜和質(zhì)譜參數(shù)條件下，將雞肉樣品和豬肉樣品空白基質(zhì)配制濃度為1.0、10.0和100.0 ng/mL 9種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用QuEChERS方法測得的信噪比(S/N)與GB/T 21312—2007方法測得的信噪比(S/N)，其比值見圖4。從圖4可以看出，隨著濃度升高，2種方法的信噪比(S/N)比值在減小，則QuEChERS方法在檢測低濃度這9種獸藥殘留有明顯優(yōu)勢。

圖4 雞肉基質(zhì)(a)和豬肉基質(zhì)(b)2種不同方法信噪比(S/N)比值Fig.4 Signal to noise ratio(S/N)ratio of chicken substrate(a)and pork substrate(b)by two different methods

2.3.2峰面積比較。在相同色譜和質(zhì)譜參數(shù)條件下，QuEChERS方法測得的峰面積與GB/T 21312—2007方法測得的峰面積的比值見圖5。從圖5可以看出，采用QuEChERS方法的樣品峰形更尖銳，響應(yīng)值更高，與GB/T 21312—2007方法的峰面積比值較大，QuEChERS方法更有利于檢測這9種獸藥。

圖5 雞肉基質(zhì)(a)和豬肉基質(zhì)(b)2種不同方法峰面積比值Fig.5 Peak area ratio of chicken substrate(a)and pork substrate(b)by two different methods

2.4 MRM提取離子色譜圖在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下雞肉基質(zhì)和豬肉基質(zhì)中9種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 ng/mL)及對應(yīng)空白基質(zhì)的總離子圖分別如圖6～9所示。

2.5 實(shí)際樣品測定按該研究所建立的QuEChERS技術(shù)和國家食品安全檢測方法GB/T 21312—2007，抽檢20份實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)地各異的雞肉和豬肉樣品，進(jìn)行喹諾酮類獸藥殘留檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2份雞肉和1份豬肉結(jié)果呈陽性，通過比較，2種方法測定結(jié)果完全一致。表明QuEChERS方法為該項(xiàng)目的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測與安全評估提供了新的技術(shù)支持。

3 結(jié)論

國家食品安全檢測方法GB/T 21312—2007采用EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH =4.0)作為提取方式，由于溶液難以澄清而導(dǎo)致堵塞固相萃取柱，國標(biāo)中EDTA-Mcllvaine緩沖液提取方式均存在不足，提取時(shí)導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)影響較大[27]。該研究采用QuEChERS技術(shù)聯(lián)合HPLC-MS/MS分析方法，能夠快速測定雞肉和豬肉中環(huán)丙沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、洛美沙星、氧氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和司帕沙星共9種喹諾酮類獸藥殘留，且方法科學(xué)合理，采用EMR-Lipid 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管，有效解決了樣品處理過程中堵塞固相萃取柱、回收率不高、存在峰形拖尾及復(fù)雜基質(zhì)有干擾等問題，與GB/T 21312—2007分析過程比較，具有操作更加簡單、檢測更加快速、除脂效果好、基質(zhì)效應(yīng)小、回收率高和靈敏度更高等優(yōu)點(diǎn)，完全滿足測定喹諾酮類獸藥殘留在雞肉、豬肉中的限量要求，為相關(guān)企事業(yè)單位的安全監(jiān)測及質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

圖6 雞肉基質(zhì)9種喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子圖Fig.6 Total ion diagram of 9 quinolone veterinary drug standard solutions in chicken substrate

圖7 空白雞肉基質(zhì)總離子圖Fig.7 Total ion diagram of blank chicken substrate

圖8 豬肉基質(zhì)9種喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子圖Fig.8 Total ion diagram of 9 quinolone veterinary drug standard solutions in pork substrate

圖9 空白豬肉基質(zhì)總離子圖Fig.9 Total ion diagram of blank pork substrate