鄧思琪，李 白，馬宇馨，曹宏哲，邢繼紅，張 康

（河北農業(yè)大學，華北作物改良與調控國家重點實驗室/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071000）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一種世界性分布的重要植物病原真菌［1］，其寄主范圍廣泛、傳播十分迅速，以菌絲、分生孢子及菌核的形式侵染，常給農業(yè)生產造成嚴重經濟損失［2-3］?；移咸焰叩木z可以在3 ～30 ℃的溫度范圍內生長，其最適生長溫度為20 ～25 ℃，且在具有相對較高濕度的環(huán)境下會引起大范圍的灰霉病發(fā)生［4-5］。到目前為止，灰霉病的防治主要為化學防治，通過在作物葉表面噴灑化學藥劑來防控灰霉病。此方法雖然高效，但灰葡萄孢變異頻繁，會產生高抗藥性，導致防治效果逐漸減弱，從而殺菌劑用量不斷增加，嚴重威脅了農產品的安全［6］。隨著基因組測序工作的完成，灰葡萄孢已經成為發(fā)育生物學、微生物學、植物病理學研究的模式生物之一，也是研究病原微生物與寄主植物互作的一種重要的模式生物。因此，充分挖掘與灰葡萄孢生長發(fā)育和致病相關基因，探究調控病菌生長發(fā)育和致病力的分子機制，不僅可以為灰霉病的生物防治提供理論依據(jù)，還可以為其他真菌的相關研究提供重要參考價值。

組蛋白乙?；潜碛^遺傳研究的重要組成部分，是翻譯后修飾的重要方式之一。Bromodomain (BRD)是一類能夠特異性識別組蛋白中乙酰化賴氨酸的保守蛋白結構域，可特異性識別組蛋白末端乙酰化的賴氨酸位點，通過與乙?；嚢彼峤Y合促使染色質重塑因子和轉錄因子等相關蛋白富集于特定的基因轉錄位點，改變RNA 聚合酶Ⅱ的活性，從而調節(jié)基因的轉錄表達［7］。Bromodomain 亦可通過對轉錄因子等非組蛋白的乙?；揎棌V泛參與細胞周期調控、細胞分化、信號轉導等過程［8］。據(jù)研究報道，所有與組蛋白乙酰化酶有關的轉錄輔激活因子都包括Bromodomains，而BRDs 也是目前已知的唯一能對賴氨酸乙?；锾禺愋宰R別的蛋白。BRD 存在于多種表觀遺傳調控蛋白中，包括轉錄激活因子、組蛋白乙?；D移酶以及染色質等。BRD 蛋白不僅單獨存在，而且常與其他組蛋白密碼解讀蛋白結構域相連［9-10］，例如 PHD 這些結構域通過協(xié)同方式調節(jié)基因轉錄、細胞周期以及細胞凋亡。雖然其大部分功能未知但值得注意的是一種溴結構域蛋白BS69，在基因轉錄抑制復合物中起著重要的作用，這表明組蛋白乙?；赡芎卸嘀氐摹⒉煌墓δ埽?1］。

Bromodomain 轉錄因子最開始在果蠅的基因中發(fā)現(xiàn)，隨后在人體組織和酵母中發(fā)現(xiàn)。目前的研究表明，Bromodomain 轉錄因子在人體中廣泛表達，主要參與染色質重塑，具有調控相關基因表達、促進細胞分化等功能，這些功能參與了成人造血干細胞的功能維持，Bromodomain 轉錄因子表達異常會導致嚴重的造血缺陷，會引起骨髓衰竭和貧血等疾?。?2-15］。擬南芥中含有擬南芥溴多糖的蛋白質BRD1、BRD2 和BRD13 可能是真正的SWI/SNF 亞基，與核心SWI/SNF 成分SWI3C 和SWP73B 相互作用，對擬南芥的基因組靶向至關重要［16-17］。在酵母中發(fā)現(xiàn)的一種溫度敏感的突變體Bromodomain factor 1，在體外可結合組蛋白H3 和H4，因此被認為在染色質重塑中起重要作用［18］。而在禾谷鐮刀菌中首次發(fā)現(xiàn)保守結構域Bromodomain 對研究FgGCN5的調控機制是必不可少的［19-20］。

目前，有關灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族的系統(tǒng)研究尚未見報道。因此，利用生物信息學的方法對灰葡萄孢中Bromodomain 轉錄因子家族進行分析，挖掘Bromodomain 轉錄因子家族成員的功能，并利用qPCR 技術分析該家族基因在NaCl 和剛果紅脅迫處理下的表達變化，探究Bromodomain 轉錄因子家族在灰葡萄孢生長發(fā)育以及致病力的分子機制，從而為灰葡萄孢防治和Bromodomain 家族基因功能和調控機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究用到的灰葡萄孢（B.cinerea）B05.10 菌株由河北農業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室提供并保存。

1.2 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的篩選與鑒定

在Ensembl Fungi（http://fungi.ensembl.org/）和 在Pfam（http://pfam. xfam. org） 中 獲 取 灰葡萄孢基因組相關數(shù)據(jù)以及隱馬爾可夫模型（HMM model），再利用Hmmsearch 軟件找出其Bromodomain 轉錄因子家族蛋白序列。

1.3 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的理化性質分析

利用ProtParam（https://web. expasy. org/protparam/）在線網頁分析灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的理化性質，包括分子量、氨基酸組成、等電點等。

1.4 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因染色體定位分析

利用在線工具Gene Structure Dispaly Server (GSDS)，將在Ensembl Fungi(http://fungi.ensembl.org/)查詢的灰葡萄孢染色體長度和灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因位置信息，使用TBtools 軟件繪制成Bromodomain 轉錄因子家族基因染色體定位圖。

1.5 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的系統(tǒng)進化分析

利用Ensembl 數(shù)據(jù)庫（http://fungi.ensembl.org/）和真菌轉錄因子數(shù)據(jù)庫（http://ftfd.snu.ac.kr/index.php?a=view）搜集灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）以及黃曲霉（Aspergillus flavus）中含有Bromodomain 結構域的蛋白序列，并利用MEGA7.0對40 條Bromodomain 轉錄因子蛋白序列（其中包含灰葡萄孢蛋白序列8 條、禾谷鐮孢蛋白序列7 條、釀酒酵母蛋白序列10 條、稻瘟病菌蛋白序列9 條、黃曲霉蛋白序列6 條）進行多序列比對，然后用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap 值設置為1 000。

1.6 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族的基因結構分析

在灰葡萄孢B05.10 基因組數(shù)據(jù)庫中找到灰葡萄孢Bromodomain 家族基因DNA 序列，利用IBS 軟件繪制灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族的基因結構圖。

1.7 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族保守結構域分析

利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http://pfam. xfam. org）網站對灰葡萄孢8 個Bromodomain 轉錄因子家族蛋白進行保守結構域分析，然后利用IBS1.0.3 軟件繪制8 個Bromodomain轉錄因子家族蛋白保守結構域。

1.8 灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在分生孢子中的表達分析

利用GEO（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）數(shù)據(jù)庫獲得灰葡萄孢分生孢子發(fā)育時期的表達譜數(shù)據(jù)，然后對Bromodomain 家族基因在不同發(fā)育時間的表達數(shù)據(jù)與對照（0 h）做比值，再取以2 為底的對數(shù)值，使用TBtools 軟件分析灰葡萄孢Bromodomain 家族基因分生孢子萌發(fā)期間的全基因組基因表達水平。

1.9 灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在侵染過程中的表達分析

利 用GEO（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）數(shù)據(jù)庫獲得灰葡萄孢侵染葡萄過程中的表達譜數(shù)據(jù)，然后對Bromodomain 家族基因在侵染不同時間的數(shù)據(jù)與對照（0 h）做比值，再取以2 為底的對數(shù)值，使用TBtools 軟件分析灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在灰葡萄孢侵染葡萄過程中的表達變化。

1.10 灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在脅迫處理下的表達分析

以0.8 mol/LNaCl 和2 mg/mL 剛果紅分別處理灰葡萄孢野生型B05.10 菌株，以未作處理的灰葡萄孢野生型B05.10 菌株為對照，處理7 d 取樣，提取RNA，利用反轉錄試劑盒合成cDNA。以灰葡萄孢β-tubulin基因為內參，用灰葡萄孢Bromodomain 家族基因的特異性引物進行qPCR 檢測（表1）。利用Primer Premier 5 設計引物，由北京博邁德基因技術有限公司合成。每個樣品重復3 次。PCR 反應體系：PCR Mix 7 μL、cDNA 2 μL、基因特異性上下游引物各0.5 μL，總體積10 μL；PCR 程序：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s， 72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)。利用GraphPad Prism 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，0.01 ＜P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

表1 用于qPCR 的引物Table 1 Primers used for qPCR

2 結果與分析

2.1 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的篩選與鑒定

在Ensembl Fungi 和 在Pfam 中 獲 取 灰葡萄孢基因組相關數(shù)據(jù)以及隱馬爾可夫模型（HMM model）， 再 利 用hmmsearch 找 出 其Bromodomain 轉錄因子家族的蛋白序列。最終鑒定出8 個灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族 成 員：BCIN_05g00170、BCIN_02g08510、BCIN_14g05240、BCIN_02g06970、BCIN_04g04900、BCIN_13g01660、BCIN_05g01870、BCIN_10g03430（見表2）。

2.2 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的理化性質分析

通過用保守結構域Bromodomain 對灰葡萄孢進行全基因組檢索，獲得了8 個灰葡萄孢Bromodomain 家族基因（表2）。分析發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢Bromodomain 家族基因編碼區(qū)CDS 長度在1 119 ～4 302 bp 之間變化；編碼蛋白的氨基酸數(shù)目為327 ～1 433 aa；相對分子質量在42 755.37 ～163 110.01 D 之間變化；等電點在5.06 ～8.91 之間，其中pI ＜7.0 的Bromodomain 家族基因有3 個，占37.5%，呈弱酸性；62.5%的Bromodomain 家族基因pI ＞7.0，這表明該家族基因編碼的蛋白富含堿性氨基酸。

表2 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的理化性質Table 2 The physicochemical properties of Bromodomain transcription factor family genes in B. cinerea

2.3 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因染色體定位分析

利用在線工具GSDS，將在Ensembl Fungi 查詢的灰葡萄孢染色體長度和灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因位置信息，繪制成Bromodomain 轉錄因子家族基因染色體定位圖（圖1）。結果發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢Bromodomain 家族的8 個基因分別處于灰葡萄孢的6 條染色體中。其中，BCIN_02g06970和BCIN_02g08510位于2 號染色體，BCIN_04g04900位于4 號染色體，BCIN_05g00170和BCIN_05g01870位于5 號染色體，BCIN_10g03430位于10 號染色體，BCIN_13g01660位于13 號染色體，BCIN_14g05240位于14 號染色體。

圖1 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因染色體定位Fig.1 Chromosomal localization of Bromodomain transcription factor family genes in B. cinerea

2.4 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的系統(tǒng)進化分析

利用Ensembl 數(shù)據(jù)庫和真菌轉錄因子數(shù)據(jù)庫搜集灰葡萄孢（B.cinerea）、禾谷鐮孢（F.graminearum）、釀酒酵母（S.cerevisiae）、稻瘟病菌（M.oryzae）以及黃曲霉（A.flavus）中Bromodomain 轉錄因子家族蛋白序列，分別包含8、7、10、9、和6 條。用MEGA7.0 軟件對Bromodomain 轉錄因子家族蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）。

圖2 灰葡萄孢Bromodomain 家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Bromodomain family protein in B. cinerea

結果發(fā)現(xiàn)40 個Bromodomain 轉錄因子家族蛋白 可 以 分 為4 個 亞 家 族：BROMO、BROMOBAH、DEXDc-HELICc-SnAC-BROMO、BROMOAT_hook。在8 個灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家 族 蛋 白 中BCIN_13g01660、BCIN_05g01870、BCIN_14g05240、BCIN_04g04900、BCIN_02g08510屬于BROMO 亞家族，BCIN_02g06970 屬于BROMOBAH 亞 家 族，BCIN_10g03430 屬 于DEXDc-HELICc-SnAC-BROMO 亞家族，BCIN_05g00170 屬于BROMOAT_hook 亞家族。

2.5 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族的基因結構分析

利用IBS 軟件繪制灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族的基因結構，發(fā)現(xiàn)該基因家族的基因結構存在明顯差異。其中BROMO 亞家族基因結構較 為 復 雜，BCIN_13g01660和BCIN_05g01870包含1 個 內 含 子，2 個 外 顯 子；BCIN_14g05240和BCIN_02g08510包 含2 個 內 含 子，3 個 外 顯 子；而BCIN_04g04900沒有內含子，只有1 個外顯子。BROMO-BAH 亞 家 族 的BCIN_02g06970包含3 個 內 含 子，4 個 外 顯 子；DEXDc-HELICc-SnAC-BROMO 亞家族的BCIN_10g03430包含2 個內含子，3 個外顯子；BROMO-AT_hook亞家族的BCIN_05g00170包含5 個內含子，6 個外顯子（圖3）。

圖3 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族基因的基因結構分析Fig. 3 Analysis of gene structure of Bromodomain transcription factor family genes in B. cinerea

2.6 灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族的結構域分析

利 用SMART 和Pfam 網 站 對 灰 葡 萄 孢8 個Bromodomain 轉錄因子家族蛋白進行保守結構域分析，并用IBS 軟件繪圖。結果如圖4 所示，8個Bromodomain 轉錄因子家族成員可分為4 類，BCIN_13g01660、BCIN_05g01870、BCIN_14g05240、BCIN_04g04900、BCIN_02g08510 屬 于BROMO 亞家 族， 其 中BCIN_13g01660、BCIN_05g01870、BCIN_04g04900、BCIN_02g08510 僅 有1 個BROMO結構域，BCIN_14g05240 含有2 個BROMO 結構域；BCIN_02g06970屬于BROMO-BAH 亞家族，含有2 個BROMO 和1 個BAH 結 構 域；BCIN_10g03430屬于DEXDc-HELICc-SnAC-BROMO 亞家族，含有4 個 結 構 域DEXDc、HELICc、SnAC 和BROMO；BCIN_05g00170 屬于BROMO-AT_hook 亞家族，包含2 個結構域BROMO 和AT_hook。

圖4 灰葡萄孢Bromodomain 保守結構域分析Fig. 4 Analysis of conserved domains Bromodomain in B. cinerea

2.7 灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在分生孢子中的表達分析

利用GEO 數(shù)據(jù)庫獲得灰葡萄孢分生孢子發(fā)育時期的表達譜數(shù)據(jù)，對灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在分生孢子發(fā)育時期的表達水平進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，該家族基因在灰葡萄孢分生孢子發(fā)育過程中的表達水平存在明顯差異，BCIN_10g03430在0 ～2.5 h 呈 下 降 趨 勢、 在2.5 ～4 h表達水平短暫升高、 在4 ～15 h 再次下調；BCIN_05g00170、BCIN_14g05240、BCIN_05g01870和BCIN_02g08510在0 ～15 h 持續(xù)下調，下調程度略有不同；BCIN_02g06970在0 ～15 h 持續(xù)上調，上調程度略有不同；BCIN_13g01660在0 ～4 h 呈下降趨勢、在4 ～15 h 上調表達；BCIN_04g04900在1 ～2.5 h 出現(xiàn)短暫的下調趨勢，其他時間幾乎無變化（圖5）。上述結果表明，灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在發(fā)育過程中呈現(xiàn)不同的表達規(guī)律，推測其參與灰葡萄孢不同時期的生長發(fā)育過程。

圖5 灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在分生孢子發(fā)育過程中的表達Fig. 5 Expression of Bromodomain family genes during conidial development of B. cinerea

2.8 灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在侵染過程中的表達分析

利用GEO 數(shù)據(jù)庫獲得灰葡萄孢侵染葡萄過程中的表達譜數(shù)據(jù)，對灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在侵染葡萄不同時期的表達水平進行分析。結果發(fā)現(xiàn)（圖6），BCIN_04g04900、BCIN_02g08510、BCIN_02g06970和BCIN_14g05240在病菌侵染過程中持續(xù)上調表達；BCIN_13g01660、BCIN_10g03430和BCIN_05g00170在病菌侵染0 ～48 h 過程中持續(xù)下調表達，下調程度有所不同；BCIN_05g01870在侵染0 ～16 h 出現(xiàn)短暫上調、在16 ～48 h 呈下調趨勢。

圖6 Bromodomain 家族基因在灰葡萄孢侵染不同時期的表達Fig. 6 Expression of Bromodomain family genes at different infection stages of B. cinerea

2.9 灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在脅迫處理下的表達分析

利用qPCR 技術對灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在NaCl 和剛果紅處理后的表達水平進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在NaCl 和剛果紅脅迫處理下的表達水平均呈現(xiàn)下調趨勢，但下調程度有所不同（圖7）。以0.8 mol/L NaCl 處理7 d 后，BCIN_04g04900、BCIN_13g01660、BCIN_05g01870以及BCIN_10g03430基因下調最為顯著，并且BCIN_10g03430幾乎不表達。以2 mg/mL 剛果紅處理7 d 后，BCIN_04g04900、BCIN_05g01870和BCIN_10g03430基因下調最為顯著。

圖7 脅迫處理對灰葡萄孢Bromodomain 家族基因表達的影響Fig.7 The effect of stress treatment on the gene expression of B. cinerea Bromodomain family

3 結論與討論

在真核細胞中，組蛋白乙?；饕山M蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；腹餐{節(jié)。研究表明，大多數(shù)組蛋白乙?；赶嚓P的轉錄激活因子均存在Bromodomain，它可以與乙?；嚢彼崽禺惤Y合［21］。Bromodomain 轉錄因子家族在動物、植物、病菌中普遍存在，家族成員較多，功能較為復雜，對于病菌的生長發(fā)育及其致病力具有重要影響［22］。目前的研究表明，人體內的Brd2 具有激酶活性，在某些白血病中激酶活性上升，它可以通過C 端序列與E2F1 或E2F2 相互作用，影響E2F 調控的細胞周期基因的轉錄［23］；而BRD4 屬于BET 家族的成員，通過結合乙?；M蛋白并調節(jié)基因表達從而參與一系列重要的生物學過程，如細胞生長、凋亡、炎癥、免疫抑制等［24］。大鼠中含溴多胺的蛋白4 表達增強，最終導致傷害性神經元興奮性增強和熱痛覺過敏［25］。在擬南芥中，組蛋白GTE9 和GTE11 與BT2相互作用，介導擬南芥中的ABA 和糖反應［26］。

Bromodomain 轉錄因子只有在模式物種酵母中有部分研究，但在其他真菌中研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢包含了8 個Bromodomain 轉錄因子家族基因，系統(tǒng)進化分析將其分為4 個亞家族，不同成員在病菌分生孢子發(fā)育的不同時期、侵染時期和NaCl 以及剛果紅脅迫處理下的表達水平存在明顯差異，因此推測Bromodomain 家族基因在灰葡萄孢分生孢子發(fā)育、侵染過程以及脅迫應答過程中具有比較重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)BCIN_02g06970在灰葡萄孢分生孢子發(fā)育的不同時期持續(xù)上調表達，推測其在灰葡萄孢分生孢子發(fā)育過程中具有重要作用。BCIN_04g04900、BCIN_02g08510、BCIN_02g06970和BCIN_14g05240在病菌侵染過程中持續(xù)上調表達，在侵染0 h 時表達水平最低，在16 ～48 h 時表達量明顯上調，因此推測其在病菌侵染過程中發(fā)揮重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)在NaCl 以及剛果紅脅迫處理下，灰葡萄孢Bromodomain 轉錄因子家族不同基因均呈現(xiàn)下調表達趨勢，因此推測其在病菌脅迫應答過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究結果初步確定了灰葡萄孢Bromodomain 家族基因在分生孢子發(fā)育、侵染過程以及NaCl 和剛果紅脅迫應答中發(fā)揮重要作用，但機制尚不明確，還有待進一步探究。