張永琪，金娟

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 黑龍江哈爾濱 150040

2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 黑龍江哈爾濱 150040

高脂血癥是常見的脂肪代謝異常的病癥，主要表現(xiàn)為甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血清膽固醇（TC）的含量超過正常標(biāo)準(zhǔn)及血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量低于正常標(biāo)準(zhǔn)[1]。目前，西醫(yī)治療高脂血癥藥物為他汀類、依澤替米貝、貝特類等[2]。然而這些藥物在臨床上可能會引起不良反應(yīng)，如胃腸道癥狀、肌病和橫紋肌溶解、肝腎功能異常等[3]。中藥能調(diào)節(jié)機(jī)體整體的血脂代謝，可明顯改善高脂血癥藥物副作用。三七含有皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分[4]，三七對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及抗炎、抗動脈粥樣硬化、止血等具有藥理作用[5]。并且三七已被證明具有顯著降低血清總膽固醇和甘油三酯的作用[6]。蒲黃含有黃酮、烷烴、有機(jī)酸、多糖等化學(xué)成分，具有抗凝、調(diào)節(jié)脂代謝及抗動脈粥樣硬化、改善糖代謝、調(diào)節(jié)免疫及抗炎等多種作用且蒲黃能調(diào)節(jié)血脂水平[7]。三七與蒲黃均屬于中醫(yī)活血止血藥物，臨床常聯(lián)合應(yīng)用，但對于三七、蒲黃的抗高脂血癥作用的相關(guān)研究進(jìn)展緩慢，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能融合多學(xué)科技術(shù)剖析藥物作用的復(fù)雜性。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從分子生物學(xué)角度系統(tǒng)地了解藥物對疾病的影響并通過分子對接進(jìn)一步驗證，為后續(xù)深入研究提供理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1 三七-蒲黃藥對活性成分的收集及靶點(diǎn)預(yù)測

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索三七-蒲黃藥對化學(xué)成分。以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為篩選條件，得到的生物活性成分及靶點(diǎn)蛋白，利用Uniport數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)名稱規(guī)范化處理，去除無法對應(yīng)基因的靶點(diǎn)蛋白。

2 高脂血癥相關(guān)作用靶點(diǎn)及藥物與疾病共同靶點(diǎn)的匹配

在 OMIM、TTD、DrugBank及 Disgenet-Gene數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上輸入疾病名稱，將“Hyperlipemia”、“Hyperlipidemia”作為檢索關(guān)鍵詞，將所有網(wǎng)站上檢索結(jié)果進(jìn)行整合后刪除重復(fù)值。在VENNY2.1.0網(wǎng)站上將兩藥物預(yù)測靶點(diǎn)與高脂血癥預(yù)測的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配。

3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）圖

在STRING數(shù)據(jù)平臺輸入共同作用靶點(diǎn)，構(gòu)建靶點(diǎn)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape3.9.1軟件繪制關(guān)鍵靶蛋白 PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)degree值找出關(guān)鍵靶點(diǎn)，用MCODE插件聚類分析找出關(guān)鍵基因簇，并實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的可視化。

4 構(gòu)建“三七-蒲黃活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

將藥物與成分、成分與共同靶點(diǎn)之間的關(guān)系匹配后分別做成Excel表格，整理后導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件繪制三七-蒲黃活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 同時采用該系統(tǒng)Network Analyzer功能分析網(wǎng)絡(luò)的屬性值，其中以連接度（degree）為觀測對象，從而預(yù)測出三七-蒲黃藥對治療高脂血癥發(fā)揮作用的主要活性成分。

5 三七-蒲黃藥對活性成分作用靶點(diǎn)功能與通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO富集分析和KEGG通路富集分析，對結(jié)果進(jìn)行可視化。

6 三七-蒲黃藥對活性成分與降脂核心靶點(diǎn)的分子對接驗證

采用AutoDock作為分子對接軟件。從STRING數(shù)據(jù)庫、AlphaFold蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載降脂的核心靶蛋白受體3D結(jié)構(gòu)。使用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得三七-蒲黃藥對化合物配體活性成分的結(jié)構(gòu)下載MOL2格式。用PyMOL軟件進(jìn)行預(yù)處理并轉(zhuǎn)換為PDB格式。將受體與配體格式文件導(dǎo)入AutoDock，進(jìn)行對接模擬計算，利用PyMOL分析和觀察對接結(jié)果。

結(jié) 果

1 三七-蒲黃藥對活性成分和對應(yīng)靶點(diǎn)篩選結(jié)果

借助TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共收集到三七化學(xué)成分119個，蒲黃化學(xué)成分33個。按檢索條件得到16個活性成分，結(jié)果得到蒲黃的活性成分8個，三七的活性成分8個。刪除無靶點(diǎn)成分3個和 2個相同成分，共計篩選得到11個活性成分，見表1。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫找到對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白，利用Uniport數(shù)據(jù)庫校正三七-蒲黃藥對靶點(diǎn)蛋白基因名稱，獲得蒲黃255個，三七196個，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共得到185個藥物活性成分作用靶點(diǎn)。

表1 三七-蒲黃藥對篩選后得到的11個活性成分

2 高脂血癥靶點(diǎn)獲取結(jié)果及藥物共同靶點(diǎn)的獲取

根據(jù)篩選條件，TTD數(shù)據(jù)庫得到2個疾病靶點(diǎn)，DrugBank數(shù)據(jù)庫得到37個靶點(diǎn)，Disgenet數(shù)據(jù)庫得到472個靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫得到6個靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，獲取高脂血癥靶點(diǎn)為185個。借助VENNY工具將其與藥物靶點(diǎn)取交集，得到57個交集靶點(diǎn)并導(dǎo)出，見圖1。

圖1 共同靶點(diǎn)韋恩圖

3 “PPI”網(wǎng)絡(luò)圖及數(shù)據(jù)分析

在STRING數(shù)據(jù)庫輸入57個共同靶點(diǎn)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)Cytoscape3.9.1軟件最終作出具有得到56個靶點(diǎn)和598個蛋白互作關(guān)系對且平均節(jié)點(diǎn)度為21.36的“PPI”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。PPI圖可以了解在高脂血癥狀態(tài)下三七-蒲黃藥對共同的靶蛋白之間的聯(lián)系和功能作用機(jī)制。degree值越高，說明這個靶蛋白可能是治療高脂血癥的關(guān)鍵。degree值前16位靶點(diǎn)分別是IL6、AKT1、TNF、IL1B等。其相關(guān) degree 數(shù)值見表2，用MCODE插件對節(jié)點(diǎn)信息聚類，得到2個子模塊，根據(jù)Score得分選擇第1個聚類，包括25個節(jié)點(diǎn)，265條邊和F3，CCL2，NOS3，MPO等靶點(diǎn)，說明該聚類在三七-蒲黃藥對治療高脂血癥功能上緊密聯(lián)系形成基因簇。

圖2 三七-生蒲黃藥對治療高脂血癥的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 前16位關(guān)鍵靶點(diǎn)

4 “三七-蒲黃活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

將三七-蒲黃藥對預(yù)測的10個活性成分57個交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1構(gòu)建“三七-蒲黃活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，其中綠色六邊形代表三七和蒲黃，粉紅色圓形代表三七的4種化合物和蒲黃的4種化合物（SQ1～SQ4分別是十八碳-6，9-二烯酸乙酯、食脂素、人參皂甙rh2、豆甾醇）；PH1～PH4分別是（2R）-5，7-二羥基 -2-（4-羥基苯基）苯并吡喃-4-酮、花生四烯酸、異鼠李素、山柰酚），黃色V形代表三七蒲黃共有2種的活性成分（A1～B2分別是β-谷甾醇、槲皮素），藍(lán)色菱形代表共同基因信息。網(wǎng)絡(luò)圖充分體現(xiàn)了三七-蒲黃藥對高脂血癥治療是通過多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜作用機(jī)制。根據(jù)degree值排名從大到小前5的活性成分為槲皮素、山柰酚、花生四烯酸、β-谷甾醇、異鼠李素，即以上活性成分是發(fā)揮治療高脂血癥的關(guān)鍵成分。見表3。

圖3 三七-蒲黃活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表3 前5位的活性成分

PH3 異鼠李素 7

5 GO富集分析

將57個共同靶點(diǎn)上傳至 David 數(shù)據(jù)庫，共富集到351個生物過程，36個細(xì)胞組成和70個分子功能。P值越小的通路與治療高脂血癥關(guān)系越為密切。根據(jù)P值篩選，每個模塊排名前10個GO富集條目，繪制條形圖，見圖4。生物過程主要包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、基因表達(dá)正調(diào)控等。細(xì)胞組成主要在細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外組分等。分子功能主要涉及酶結(jié)合等。表明三七-蒲黃藥對的有效成分可能在細(xì)胞外間隙等細(xì)胞位置通過進(jìn)行細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路等多種生物調(diào)控過程來表達(dá)其酶結(jié)合等分子功能來治療高脂血癥。

圖4 GO富集分析

6 KEGG通路分析

對57個靶蛋白進(jìn)行 KEGG 通路分析，得到132條信號通路。三七-蒲黃藥對調(diào)節(jié)高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)富集通路按照P值從大到小排列其中前20繪制氣泡圖，見圖5。主要涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化等。

圖5 KEGG通路分析氣泡

7 分子對接驗證

為預(yù)測三七-蒲黃藥對降脂作用機(jī)制，用Autodock軟件進(jìn)行分子對接驗證。將“三七-蒲黃活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖degree值排名前3位的槲皮素、山柰酚、花生四烯酸這些三七-蒲黃藥對關(guān)鍵活性成分配體與IL6、AKT1、TNF、IL1B高脂血癥核心靶點(diǎn)蛋白受體進(jìn)行逐一對接，見表4，將結(jié)合能活性最強(qiáng)的前8位對接結(jié)果制成分子對接驗證圖，見圖6。綜合分析，槲皮素、山柰酚、花生四烯酸與其對應(yīng)的核心靶點(diǎn)均具有較好的親和力，與靶點(diǎn)AKT1、IL6和IL1B較好結(jié)合的是槲皮素，與靶點(diǎn)TNF較好結(jié)合的是山柰酚。與預(yù)測結(jié)果相吻合，說明有效成分可以較好地調(diào)節(jié)作用于對應(yīng)的靶點(diǎn)，可能是三七-蒲黃藥對降脂的關(guān)鍵活性成分。利用分子對接方法進(jìn)一步驗證了三七-蒲黃藥對抗高脂血癥的作用機(jī)制。

圖6 分子對接驗證圖

表4 三七-蒲黃藥對關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)三七-蒲黃藥對治療高脂血癥的核心活性成分可能為槲皮素、山柰酚、花生四烯酸、β-谷甾醇、異鼠李素等。其中槲皮素在網(wǎng)絡(luò)圖中度值最高，是降脂關(guān)鍵成分。有研究表明槲皮素能調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)，改善肝臟脂肪變性[8]。實驗研究發(fā)現(xiàn)山奈酚可抑制食欲，有效減重和去脂肪堆積，刺激與肝細(xì)胞中脂肪酸氧化和攝取相關(guān)的基因表達(dá)，降低肝臟總膽固醇水平、降低血清甘油三酯水平進(jìn)而改善高脂血癥[9-11]?；ㄉ南┧幔ˋA）及其衍生物在糖尿病、非酒精性脂肪肝等常見疾病的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用與糖脂代謝密切相關(guān)[12-13]。動物實驗表明適宜的花生四烯酸水平可以上調(diào)或下調(diào)肝臟中一些與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量從而改善脂質(zhì)代謝[14]。β-谷甾醇參與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，顯著改善小鼠脂肪肝和代謝異常，并通過受體膽固醇結(jié)合位點(diǎn)與膽固醇競爭影響高膽固醇中的CCK1R功能，可能將其構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)檎亩l(fā)揮其降脂作用[15-16]。異鼠李素能減輕氧化應(yīng)激，緩解游離脂肪酸對L-02細(xì)胞誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積，抑制非酒精性脂肪性肝炎誘導(dǎo)小鼠的脂肪生成途徑來減少肝內(nèi)脂質(zhì)積累和甘油三酯含量發(fā)揮降脂作用[17-18]。槲皮素具有抗菌抗炎和降血脂等作用，有實驗研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能降低肝脂質(zhì)脂肪變性并抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，例如TNF-α，IL-6和IL-1β[19-20]。有研究報道β-谷甾醇有促脂解作用可能與下調(diào)AKT、PI3K的表達(dá)有關(guān)[21]。以上研究為三七-蒲黃活性成分治療高脂血癥提供有力支撐。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖顯示三七-蒲黃藥對作用的靶點(diǎn)包括IL6、AKT1、TNF、IL1B等。其中IL6、TNF、IL1B等靶點(diǎn)與炎癥過程相關(guān)。炎癥反應(yīng)可刺激脂肪細(xì)胞的生物學(xué)過程如氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌及對胰島素敏感性等，從而導(dǎo)致血脂代謝紊亂[22]。提示三七-蒲黃藥對活性成分可能通過降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮治療作用。先前研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Akt1表達(dá)的小鼠免受飲食引起的肥胖及其相關(guān)的胰島素抵抗[23]，因此與治療高脂血脂癥關(guān)系密切。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示關(guān)鍵基因靶點(diǎn)富集的主要通路涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。研究表明動脈粥樣硬化與脂質(zhì)代謝紊亂緊密相關(guān)，其中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）是動脈粥樣硬化的公認(rèn)介質(zhì)，也是動脈粥樣硬化性心血管疾病一級和二級預(yù)防干預(yù)的關(guān)鍵指標(biāo)[24]。高血糖相關(guān)的晚期糖化終產(chǎn)物（AGEs）和AGE受體（RAGE）有助于非酒精性脂肪性肝病，能誘導(dǎo)肝脂肪變性[25]。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路被認(rèn)為與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[26]。

研究結(jié)果顯示，三七、蒲黃中的槲皮素、山柰酚、花生四烯酸、β-谷甾醇、異鼠李素等關(guān)鍵有效成分可能作用于IL6、AKT1、TNF、IL1B等多個靶點(diǎn)影響多個生物過程和脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等信號通路治療高脂血癥并利用分子對接方法進(jìn)一步得到驗證。通過本研究可以了解三七－蒲黃藥對治療高脂血癥作用機(jī)制，為應(yīng)用三七-蒲黃藥對治療高脂血癥提供了科學(xué)的依據(jù)。希望今后能有更完善的動物實驗和相關(guān)臨床研究對以上分析再加以驗證。