施禮科，葉 鍵，王 力，姜路辛，蔣 靜

(杭州市農(nóng)機技術推廣中心，浙江杭州 310017)

南美白對蝦是當前世界上養(yǎng)殖規(guī)模最大、產(chǎn)量最高的對蝦，具有肉質(zhì)鮮美、抗病力強、生長迅速等特點。隨著養(yǎng)殖面積的擴大和集約化生產(chǎn)的發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，病害頻發(fā)，極大地制約了南美白對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其中十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，以下簡稱DIV1)是近年來流行的主要病原之一。DIV1感染可引起養(yǎng)殖對蝦短時間內(nèi)暴發(fā)大面積死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失。2020年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、海關總署正式將DIV1列位二類疫病。

2021年，杭州市農(nóng)機技術推廣中心選取了幾家典型的南美白對蝦養(yǎng)殖場進行DIV1 跟蹤檢測，其中一家養(yǎng)殖場在養(yǎng)殖后期加注外源河道水兩天后發(fā)生病害。根據(jù)發(fā)病前場內(nèi)對蝦檢測均呈現(xiàn)病毒陰性的情況，筆者對可能的病毒來源進行了分析，并取樣檢測，初步發(fā)現(xiàn)外源水為重要傳染來源。同時進行了實驗室感染驗證，現(xiàn)將相關情況總結(jié)如下。

一、檢測樣品獲取

在杭州市設立南美白對蝦跟蹤監(jiān)測點3個，放苗前及放苗后每月對場內(nèi)對蝦取樣檢測DIV1。取樣方法按照《水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術規(guī)范》(SC/T 7103-2008)規(guī)定進行，取苗時盡量選活力較弱的蝦苗。每份樣品加貼采樣標簽，并填寫《蝦苗現(xiàn)場采樣記錄表》。河道水病毒采取直接取水100微升進行檢測。

二、檢測方法

DNA 提取使用Qiagen DNA Mini Kit 試劑盒，使用套式PCR 方法對獲取樣品進行DIV1 檢測。第一步擴增引物SHIV-F1：5＇-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3＇和SHIV-R1：5＇-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3＇；第二步擴增引物SHIV-F2：5＇-CGGGAAACGATTCGTATTGGG-3＇和SHIV-R2：5＇-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3＇。第一步擴增程序為95℃變性；95℃30 秒、59℃30 秒、72℃30 秒，35 個循環(huán)；72℃延伸2 分鐘。第二步擴增程序為95℃變性；95℃30 秒、59℃30 秒、72℃20 秒，35 個循環(huán)；72℃延伸2分鐘。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后，回收第二步擴增陽性條帶，送Takara 公司進行克隆測序。測序所得序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析。

三、實驗室感染模型構(gòu)建

實驗用蝦購自杭州市某淡化苗種場，經(jīng)檢測未攜帶DIV1。飼養(yǎng)密度為每28 升水體養(yǎng)殖40 尾，飼養(yǎng)至3厘米規(guī)格后進行人工感染實驗。人工感染分實驗組和對照組，每個組別各設3 個養(yǎng)殖單位。實驗組按養(yǎng)殖水體1/3 的量加入受污染的河道水，之后實驗組和對照組按每天兩次正常投喂飼料；7 天后每個養(yǎng)殖單位取10 尾蝦，解剖獲得肝胰腺，混合后檢測DIV1。

四、結(jié)果與分析

1.發(fā)病養(yǎng)殖場病樣診斷及外源河道水檢測

病蝦出現(xiàn)空腸、空胃、肝胰腺顏色變淺萎縮、體色變紅等癥狀(圖1)，游動能力和反應減弱。對發(fā)病養(yǎng)殖場內(nèi)蝦苗、外源河道水、病蝦肝胰腺檢測DIV1，第一次擴增外源河道水和發(fā)病蝦肝胰腺呈現(xiàn)陽性(圖2)，其中發(fā)病蝦肝胰腺呈現(xiàn)強陽性；擴增蝦苗(苗池加注了外源水)、外源河道水、發(fā)病蝦肝胰腺均呈陽性(圖3)。結(jié)合癥狀初步判斷，病蝦為十足目虹彩病毒病，場內(nèi)蝦苗(苗池加注了外源水)為DIV1 弱陽性，外源河道水為DIV1陽性。

圖1 病蝦

圖2 套式PCR第一步擴增

圖3 套式PCR第二步擴增

2.實驗室感染結(jié)果

實驗組3個養(yǎng)殖單位南美白對蝦肝胰腺第一次和第二次擴增均呈DIV1 陽性，對照組3 個養(yǎng)殖單位南美白對蝦肝胰腺第一次和第二次擴增均呈DIV1 陰性(圖2、圖3)

3.陽性產(chǎn)物測序結(jié)果

陽性產(chǎn)物測序所獲得序列長度及BLAST結(jié)果見表1，所有陽性產(chǎn)物測序結(jié)果均為DIV1 ATPase gene。

表1 陽性產(chǎn)物測序結(jié)果

五、討論

該批次發(fā)病南美白對蝦在放養(yǎng)前對蝦苗進行過檢測，未檢出DIV1，跟蹤檢測結(jié)果也一直呈現(xiàn)陰性，換水兩天后暴發(fā)十足目虹彩病毒病，且外源河道水DIV1 呈陽性。結(jié)合實驗室人工感染實驗驗證，初步判斷此病例為加注受污染的外源河道水引發(fā)。南美白對蝦養(yǎng)殖后期通常為晴熱高溫天氣，養(yǎng)殖戶往往會加注外源水對養(yǎng)殖池塘進行水量補充，因此，加注外源水時需謹慎，最好先經(jīng)過檢測，確保加注的外源水不攜帶病原。

跟蹤檢測中發(fā)現(xiàn)，發(fā)病場同時用攜帶DIV1 的水源對成蝦和蝦苗的養(yǎng)殖塘進行水量補充，成蝦池暴發(fā)病害，苗種檢測呈弱陽性。后期進一步跟蹤這批陽性苗種，30 天后檢測DIV1，結(jié)果呈陰性，推測養(yǎng)殖后期加注新水對成蝦造成應激而發(fā)病。而蝦苗檢測結(jié)果呈弱陽性可能為腸道內(nèi)攜帶病毒導致，實際未感染，因此后期檢測結(jié)果為陰性。

繼續(xù)飼養(yǎng)實驗組已感染DIV1 的南美白對蝦至后期，該批南美白對蝦始終未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，這表明DIV1 發(fā)病需要一定的條件。實驗室養(yǎng)殖環(huán)境比較穩(wěn)定且單一，養(yǎng)殖南美白對蝦應激少，推測為后期不發(fā)病的原因之一。